Dergiler / Journal of advances in vetbio science and techniques / 2016 / Cilt: 1 - Sayı: 1
Kriyoprezervasyon Uygulanmış Balık Sperm Hücrelerinde DNA Hasarının Tespitinde Farklı Comet Analizi (Tek Hücre Jel Elektroforezi) Metotlarının Uygulanmaları
- Sayfa
- 6–13
- DOI
- —
Özet
Kriyoprezervasyon, hem insan hem de hayvan gametlerinin, hatta embriyolarının, başarılı bir şekilde uzun süreli saklanması için yaygın olarak kullanılan yardımcı üreme tekniklerindendir. Ayrıca, sperm kriyoprezervasyonun birçok avantajı vardır. Örneğin, balıklarda suni döllemenin geliştirilmesinde, genetik manipülasyonların kolaylaştırılmasında, erkek anaç stokunun azaltılmasında kullanılır. Ancak kriyoprezervasyon sonrası, sperm hücrelerinde sonrasında dölleme ve yumurtadan çıkış oranlarının azalmasına sebep olacak motilite kaybı ve DNA hasarı gibi problemler ile oluşabilir. Comet analizi, DNA sarmalındaki kırıkları tek bir sperm hücresi seviyesinde tespit edebilen basit ve hassas bir araçtır. Bu çalışmada, farklı kimyasal maddeler ve uygulama zamanlarına sahip üç farklı Comet analiz metodu balık sperm hücrelerine uygulanmıştır. Olgun sazan balığı (Cyprinus carpio) bireylerinden alınan sperm örnekleri bu çalışmada kullanılmıştır. Öncelikle, taze sperm örnekleri kullanılarak, her metot için liziz solüsyonuna 12, 25 ve 50 µM H2O2 eklenerek DNA hasarı sınıflandırılmıştır. Böylece, DNA hasarı, her hücre DNA’sının oluşturduğu kuyruk uzunluğuna göre floresan mikroskop altında incelenerek görsel olarak, 1. 2. ve 3. dereceden hasarlı ve H2O2 eklenmemiş örnekler 0 (hasarsız) olarak ölçeklendirilebilir. Sonrasında, kriyoprezervasyon uygulanmış sperm örnekleri çözündürülerek, üç farklı Comet analiz metodu uygulanmıştır. Üç metoda ait yüzde hasarsız DNA sonuçları (%67,7±2,0; % 69,3±1,8 ve %68,2±2,8) arasında ve toplam hasarlı DNA sonuçları (%32,3±2,0; % 30,7±1,8 ve %31,8±2,8) arasında istatistiki olarak önemli derece fark saptanamamıştır. Buna karşın, DNA hasar sınıflandırmaları arasında bazı istatistiksel farklılıklar bulunmaktadır. Sonuç olarak, her üç metot hasarsız ve toplam hasarlı DNA tespitinde benzer başarıyı göstermekte iken DNA hasar sınıflarının tanımlanmasında farklılıklar olabilmektedir.
Abstract
Cryopreservation as an assisted reproduction method is commonly used for successful long-term storage of not only human but also animal gametes, even their embryos. Moreover, cryopreservation of sperm offers many advantages. In fish, for instance, it is useful for improving artificial reproduction, facilitating genetic manipulation, and reducing the amount of male breeders stocks. However, after cryopreservation, sperm cell could have some problems such as loss in motility and DNA damage, leading to lower fertilization and hatching rates. The comet assay is a simple, but sensitive tool for detecting strand breaks in DNA in single sperm cells. In this study, three comet assay methods which contain different chemical agents and have different application times were carried out on fish sperm. The mixed sperm samples obtained from mature carp (Cyprinus carpio) males were used in the experiments. Firstly, using fresh sperm samples, DNA damage is classified by means of lysis solutions of each used method without H2O2 and with 12, 25 and 50 µM H2O2. Thus, DNA damage is visually scored by measuring the DNA tail of each sperm cell in fluorescent microscope images as positive control (undamaged DNA), 1, 2, and 3 classes of damage, referring from the less to more damaged sperm cells. Secondly, after thawing, cryopreserved sperm samples were applied by the comet assay methods. The results of three methods have shown no significant differences among the percentages of undamaged DNA (67.7±2.0 %, 69. 3±1.8 % and 68.2±2.8 %) and total damaged DNA (32.3±2.0 %, 30.7±1.8 % and 31.8±2.8 %) of sperm cells as. On the contrary, there were some statistical differences among the classes of damage. Consequently, all methods have been found successful in detection of undamaged and total damaged DNA but not in the recognition of the damage classes.