Production, purification, and characterization of α-amylase by Bacillus subtilis and its mutant derivates

Bacillus subtilis ve mutant türevleri tarafından α-amilazın üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu

Özet

Çalışmada, B. subtilis ve onun mutant türevleri tarafından α-amilazın üretimi üzerine çeşitli karbon ve azot kaynaklarının etkisi araştırıldı. Tüm suşlar tarafından maksimum α-amilaz üretimi karbon kaynağı olarak mesoinositol varlığında elde edildi. Azot kaynaklarının ilavesi durumunda enzim veriminde önemli bir atış olmadığı görüldü, ancak malt ekstrat B. subtilis, tripton mutant U 2-6 tarafından amilaz üretimi için tercih edilen azot kaynaklarıydı. B. subtilis ve mutant suşu (EBUE 5-3)’nun α-amilazları bir seri basamakta saflaştırıldı ve karakterize edildi. Saflaştırılan α-amilazların optimum sıcaklık ve pH değerleri sırasıyla 45 °C ve 6,0 olarak bulundu. Mutant suşun enzimi alkali koşullarda ana suş enziminden daha stabildi (pH 8,0’de 1 saat % 85). Her iki amilazın The $K _m ve V _{max}$ değerleri karşılaştırıldı. Enzimler $Cu^ {2+}, Hg^ {2+} ve Ag^ {2+}$ tarafından güçlü olarak inhibe edildi, fakat enzim $Ca^ {2+}, Ba^ {2+}, Mg^ {2+}, Li^ {2+}$ ve Mn2+ tarafından aktive edildi. 1 mM metal iyon konsantrasyonu enzim aktivitesi üzerine 5 mM’den daha büyük etkiye sahipti. Saflaştırılan enzimlerin tahmini moleküler ağırlıkları 56 kDa’du. Ana ve onun mutant suşu tarafından üretilen amilazların N-terminal amino asit sekansları homoloji gösterdi.

Abstract

The effects of various carbon and nitrogen sources on production of α-amylase by Bacillus subtilis and its mutant derivates were investigated. The maximum production of α-amylase by all strains was obtained in the presence of mesoinositol as the carbon source. There was no more significant increase in enzyme yield in the case of the supplementation of nitrogen sources, whereas malt extract and tryptone were preferred nitrogen sources for amylase production by Bacillus subtilis and mutant U 2-6 strain, respectively. α-Amylases of B. subtilis and its mutant strain (EBUE 5-3) were purifi ed through a series of steps, and characterized. The optimum temperature and pH values of the purifi ed amylases were found to be 45 °C and 6.0, respectively. The enzyme of mutant strain had more stability than the enzyme of the parental strain in alkaline conditions (85% at pH 8.0 for 1 h). The $K _m and V _{max}$ values of both amylases were also compared. Enzymes were strongly inhibited by$Cu^ {2+}, Hg^ {2+} and Ag^ {2+}$, but activated by$Ca^ {2+}, Ba^ {2+}, Mg^ {2+}, Li^ {2+}$, and Mn2+. Metal ion concentration of 1 mM had a greater effect on enzyme activities than 5 mM did. The estimated molecular weight of the purified enzymes was 56 kDa. The N-terminal amino acid sequence of amylases produced by the parental and the mutant strain showed homology.