Hızlı, Hassas ve Kolay HPLC-UV 25(OH)D Tayini ve İmmün Ölçüm Yöntemi ile Karşılaştırılması

A Simple, Sensitive and Rapid HPLC-UV Method for the Determination of 25(OH)D and Comparison of the İmmunoassay Method

Özet

Amaç: D vitamini eksikliği, ülkemizde yaygın görülen bir halk sağlığı sorunudur. Eksiklik prevelansını belirlemeye dair yapılan çalışmalarda %90’lara ulaşan verilere rastlamak mümkündür. Son yıllarda bu eksikliğin basın yayın yoluyla da sıkça gündeme getirilmesi, halkımızı kan düzeyinin takibi ile ilgili bir arayışa yönlendirmiştir. Bu sebeplerle laboratuvarlarda D vitamini test sayılarında ciddi artışlar yaşanmaktadır. Hasta başı test maliyetlerinin yüksek olması nedeniyle de laboratuvar harcamaları içerisinde ön sıralarda yer almaktadır. Laboratuvar maliyetlerinin düşürülmesi, 25(OH)D2 ve D3 formlarının ayrı ayrı belirlenebilmesi için ön hazırlık aşaması kolay, hızlı ve hassas ‘in-house’ bir analiz yöntemi geliştirilmesi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Yöntem geliştirilmesinde Ultimate 3000 HPLC-UV (Dionex, Germany) cihazı, yöntem karşılaştırma çalışması amacıyla da Architect 25(OH)D kiti (Abbott Diagnostic, USA) kullanılmıştır. Validasyon çalışmaları CLSI kılavuzları kullanılarak yapılmıştır (EP5-A2,EP6-A,EP9-A2). Doğruluk, Sertifikalı Referans Malzeme (UME CRM 1308) aracılığıyla değerlendirilmiştir. Kromatografik ayrım için ters faz 150mmX4.6mm,(3.0μm) ODS-1(Thermo Scientific, USA) analitik kolon tercih edilmiştir. Bulgular: Çalışma içi, çalışmalar arası ve günler arası %CV değerleri 18.9ng/mL 25(OH)D3 için sırasıyla %2.6, %2.7 ve %6.3 olarak, 57.4ng/mL için ise %1.8, %1.8 ve %4.8 olarak belirlendi. 25(OH)D3 testi için LOD değeri 0.7ng/mL, LOQ değeri ise 2.1ng/mL olarak tespit edildi. HPLC-UV ve Abbott Architect sistemleri arasındaki uyum Passing Bablok regresyon analizi ile değerlendirildi (y=0,89x+1,81). Sonuç: HPLC-UV ve Abbott Architect arasındaki uyum her iki yönteminde tercih edilebileceğini düşündürmektedir. Ancak her laboratuvar 25(OH)D tayini amacıyla yöntem seçiminde içerisinde bulunduğu şartlara göre karar vermelidir. Çünkü test performanlarının birbirlerine oldukça benzer olduğu bu gibi durumlarda yöntem seçiminde hasta sayısı, tecrübeli personel varlığı ve maliyet belirleyici parametreler olarak daha ön planda yer alacaktır.

Abstract

Aim: Vitamin D deficiency is a common public health problem in our country. It is possible to find data reaching 90% in studies about determining deficiency prevalence. In recent years, this deficiency has been attracted the attention of the press and has directed people to a search for blood level monitoring. For these reasons, there are also serious increases in the number of vitamin D levels analyses in laboratories. Due to the high measurement costs per patient, it is also one of the most important laboratory expenses. It is aimed to develop an simple, sensitive and rapid ‘in-house’ analysis method in order to reduce laboratory costs and to determine 25(OH)D2 and D3 forms separately. Material and Methods: Ultimate 3000HPLC-UV (Dionex, Germany) was used in the development of the method. Architect 25(OH)D kit (Abbott Diagnostic, USA) were used for method comparison study. Validation studies were performed using CLSI guidelines(EP5-A2,EP6-A,EP9-A2). Accuracy was evaluated using Certified Reference Material (UME CRM 1308). For chromatographic separation, reverse phase 150mmX4.6mm,(3.0 μm) ODS-1 (Thermo Scientific,USA) analytical column was used. Results: Within run, between run and between day precisions (%CV) for 18.9ng/mL 25(OH)D3 were 2.6%, 2.7%, 6.3% and for 57.4ng/mL were 1.8%, 1.8% and 4.8% respectively. For 25(OH)D3, the LOD was 0.7ng/mL and the LOQ was 2.1ng/mL. Correlation between HPLC-UV and Abbott Architect systems was evaluated by Passing Bablok regression analysis (y=0,89x+1,81). Conclusion: The compatibility between HPLC-UV and Abbott Architect suggests that both methods can be preferred. However,each laboratory should decide according to the their conditions in which the method is selected for the determination of 25(OH)D. Because in such cases where test performances are very similar. The number of patients, experienced staff presence and cost-determining parameters will be more prominent in the selection of methods,