Fasciola hepatica cathepsin L1 geninin klonlanması ve rekombinant plazmitlarin polimeraz zincir reaksiyon taraması ile belirlenmesi

Cloning of the Fasciola hpatica cathepsin L1 gene and detection of recombinant plasmids by PCR screening

Özet

Bu çalışmada, ülkemizin bir sorunu olan fasiyoloza karşı geliştirmeyi tasarladığınız hızlı serolojik tanı testleri ve DNA aşısı çalışmalarına temel oluşturmak üzere F hepatica Cathepsin L1 protease geninin klonlanması amaçlanmıştır. Doğal olarak infekte sığır karaciğerinin safra yollarından elde edilen yetişkin F. hepatica'lar kullanıldı. TRI reagent kullanılarak toplam RNA elde edildi. Tersine Transkripsiyon ve PZR işlemi için primerler (FhP1 ve FhP2) Genbank EMBL L33771'den yaralanılarak dizayn edildi. Tersine Transkripsiyon ile elde edilen cDNA (F. hepatica'nın Cathepsin L1 geni) PZR ile çoğaltıldı. cDNA, Wizard® Minicolunm (Wizard PCR Preps DNA Purification Systemi) kullanılarak saflaştırıldı ve pTARGET Mammalian Expression Systemi kullanılarak vektöre yerleştirildi. Transformasyon için, E. coli JM109 hücreleri kullanıldı. Hücrelerin istediğimiz rekombinant plazmidi içerip içermediğini tespit etmek için PZR-T işlemi yapıldı. Klonlama işlemi ayrıca enzim kesim deneyi ile de doğrulandı. Bu çalışma, daha özgül serolojik yöntemlerde kullanılabilecek olan Cathepsin L1 proteinlerinin elde edilmesine bir basamak oluşturacaktır. Ayrıca pFhTCL1'in DNA aşısı olarak gelecekte kullanılabilecek olması ayrı bir önem taşımaktadır.

Abstract

The aim of this study was to clone the F hepatica Cathepsin L1 gene that will allow us to develop more reliable serological diagnostic tests and DNA immunization studies against F. hepatica that is problematic in Turkey. In this study, mature F hepatica obtained from bile ducts of the liver of naturally infected cattle was used. Total RNA was obtained using the TRI reagent. The primers FhP1 and FhP2 designed using Genebank EMBL L33771 were used for the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). After RT-PCR, PCR products of F hepatica Cathepsin L1 gene were purified in the Wizard mini-column (Wizard PCR Preps DNA Purification System) and cloned into the pTargeT mammalian expression vector. E. Coli JM109 competent cells were used for transformation. In order to test whether the bacterial colonies contained recombinant plasmids, PCR screening assays were done that was confirmed by further PCR screening assays. In the future, cloning of F hepatica Cathepsin L1 gene into an expression vector will be used for developing more sensitive serological methods. More important is the fact that pFhTCL1 is going to be a good candidate for DNA vaccination.