Rolling circle transcription of ribozymes from promoterless single-stranded DNA nanocircles in mammalian cells

Ribozimlerin, promotorsuz tek-iplikli DNA çemberlerinin rolling circle transkripsiyonu ile memeli hücrelerinde üretimi

Özet

Tek iplikli, promotorsuz çembersel DNA’lardan (73 nt) kendisini kataliz edebilen firkete ribozimler memeli hücrelerinde sentezlenmiştir. Lipitlere dayalı transfeksiyon yöntemi ile DNA çemberleri, sürekli T7 RNA polimeraz üreten ve bunu sitoplazmada tutan fare L hücreleri (OST7–1) tarafından başarılı bir şekilde içeri alınmıştır. Kalıp DNA çemberlerinin hücrelere alınması ve hücre içi ribozim transkriptlerinin sentezi zamana bağlı olmuş, her ikisi de 24 saatte maksimum düzeylerine ulaşmışlardır. Hücre içi transkripsiyon sonucu konkatemerik RNAlar sentezlenmiş ve bunların seviyesi her hücrede ~100 kopyaya ulaşmıstır. Transkripsiyon bilinen bir promotor dizisinden bağımsız ancak T7 RNA polimerazına bağımlı olarak gelişmiştir. Burada verilen bilgiler, DNA dupleksindeki tek iplikli balon bölgelerinin RNA transkripsiyonu için yalnız in vitro değil aynı zamanda memeli hücre sitoplazmalarında da de novo başlangıç bölgelerinin olabileceği hipotezini desteklemektedir. Bu sonuçlar, küçük nükleik asit çemberlerinin memeli hücrelerinde “rolling circle” transkripsiyonu için bir model oluşturabilir.

Abstract

Self-processing hairpin ribozymes have been synthesized from promoterless singlestranded DNA circles (73 nt) within mammalian cells. Following lipid-mediated transient transfection, DNA circles were efficiently internalized by mouse L cells (OST7–1) that stably express T7 RNA polymerase confining it to the cytoplasm. Cellular uptake of circular DNA templates and intracellular accumulation of ribozyme RNA transcripts from these DNA circles were progressive, both peaking at 24 h after transfection. Intracellular transcription generated RNA concatemers accumulating to a level of ~100 copies per cell. Transcription appears to be independent of specific promoter sequences but depends on T7 RNA polymerase. The data presented here may support the hypothesis that single stranded bubble regions within duplex DNA can serve as de novo initiation sites for RNA transcription not only in vitro but also in the cytoplasm of mammalian cells. These results may provide a model for the rolling circle transcription of small circular nucleic acids in mammalian cells.