Intrinsic tryptophan fluorescence and related energy transfer in Leghemoglobin isolated from Arachis hypogea

Arachis hypoge’dan izole edilmiş Leghemoglobin’lerde içsel Triptofan floresan ve floresana bağlı enerji transfer çalışmaları

Özet

Amaç: Bu projenin amacı heme taşıyan ve bir leguminous protein olan Leghemoglobin'in (Lb) içsel triptofan floresanı ve bu floresanın 1-anilinonaphthalene-8-sulphonate (ANS) floresanı ile olan etkileşimi incelenerek yapısal özelliklerini araştırmaktır. Bu amaç doğrultusunda Lb'nin erime ısısı, kuantum değeri ve enerji transfer özellikleri diğer globular proteinlerle karşılaştırılacaktır.Yöntem: Bu çalışmada, proteinlerdeki Förster enerji transferinin hesaplanması için içsel triptofan floresanı, dışarıdan eklene ANS probu ve UV uyaranı kullanılmıştır. Arachis hypoge'dan izole edilen Lb proteinin karakterizasyonunda kuantum değeri ve erime ısısı tayin edilmiştir. were determined to characterize Lb isolated from Arachis hypogea. Bulgular: ANS probunun BSA, lysozyme, ovalbumin (Oval) ve Sitokrom-C (Cyt-C) gibi proteinlerle etkileşmesi sonucunda içsel triptofan floresansına dayalı enerji transferinden dolayı ANS floresansında bir artış tespit edilebilmektedir. Förster denklemi kullanılarak içsel triptofan ve ANS arasındaki bu enerji transferinin nekadar kuvetli olduğu hesaplanabilmektedir. 295 nm ve 375 nm ile uyarılmadan sonra hesaplana bağlanma katsayıları farklılık göstermektedir. Bu sonuçlar Lb'nin farklı bir yolağına sahip olabileceğini göstermektedir. ANS nin Lb'ye yüksek bir KD dolayısı ile düşük bir bağlanma afinetisi ile bağlanması bu bulguyu desteklemektedir. Sonuç: Arachis hypogea'dan izole edilen ve büyük tarımsal önem taşıyan Lb proteininin spektroskopik özelliklerinin çalışıldığı bu çalışma Lb proteinin yapısal verisi bulunmadığından büyük önem taşımaktadır. Çalışmamızda heme taşıyan globular proteinlerin termal dayanıklılık yönünden karşılaştırılmış ve sıralama Hb > Lb > Cyt-C şeklinde tespit edilmiştir. Lb protein için TrpANS arasındaki kuantum değeri ve bağlanma katsayıları belirlenmiştir. Trp-ANS için hesaplana Föster uzaklığı LB ve diğer hme taşıyan globular proteinler için tespit edilmiş ve şu şekilde sıralanmıştır: Oval < Lb < BSA < Cyt-C < Lysozyme

Abstract

Objective: To explore the structural properties of heme containing leguminous protein Leghemoglobin (Lb) by means of intrinsic tryptophan (Trp) fluorescence and interaction with fluorescent dye 1-anilinonaphthalene-8-sulphonate (ANS). Hence to compare the melting temperature, quantum yield and energy transfer properties of Lb with other standard globular proteins.Method: Intrinsic Trp fluorescence, extrinsic probe ANS, UV fluorescent signal were used to investigate Förster energy transfer in the proteins. Quantum yield and melting temperature (Tm) were determined to characterize Lb isolated from Arachis hypogea. Result: Binding of ANS with the proteins Bovine serum albumin (BSA), lysozyme, Ovalbumin (Oval) and Cytochrome-C (Cyt-C) manifested differential enhancement of ANS fluorescence revealing energy transfer from Trp. Förster equation was used to estimate the efficiency of energy transfer from Trp to ANS. Estimated binding constants were different for 295 nm and 375 nm excitation suggesting the involvement of an additional pathway in Lb via Förster resonance energy transfer (FRET). This is reflected in higher KD value indicating lower binding affinity of ANS-Lb. Conclusion: This is a pioneering endeavor to unfold the structural properties of Lb isolated from Arachis hypogea, since there is no report regarding the spectroscopic properties of this protein, which is of immense agricultural importance. Our work revealed a comparison of thermal stability of heme containing globular proteins which followed the order: Hb > Lb > Cyt-C. Quantum yield and the binding constant for Trp-ANS interaction of Lb were determined. Apparent distance for Trp-ANS energy transfer in Lb and other globular proteins were explored to follow the order:Oval < Lb < BSA < Cyt-C < Lysozyme