Amiloid Beta Peptit ve Nöroaktif Steroid Uygulamasına Karşı İnsan ve Sıçan Nöronal Hücrelerinin Vital Yanıtlarının Değerlendirilmesi

The Assessment of Vital Responses of Human and Rat Neuronal Cells Against to Amyloid Beta Peptide and Neuroactive Steroid Treatment

Özet

Amiloid beta (Aβ) peptit ile oluşturulan toksisite Alzheimer hastalığı için geçerli in vitronöral dejenerasyon modellerinden biridir. Sinir sisteminde sentezlenmeleri ve nörotransmittergibi davranmaları nedeniyle nöroaktif steroidler olarak adlandırılan steroidlerin en bellibaşlıları pregnenolon (P), pregnenolon sülfat (PS)'tır. Sentezleri iskemi ve Aβ, glutamatuygulaması gibi iç ve dış uyaranlarla tetiklenebilen P ve PS'nin vital nöronal fonksiyonlarüzerindeki etkisi yeterince bilinmemektedir. Çalışmamızda insan ve hayvan kaynaklı iki farklınöronal hücre hattında, P ve PS'nin Aβ uygulaması ve hücre canlılığına etkilerinindeğerlendirilmesi amaçlandı. Ayrıca oluşturulan in vitro nörodejenerasyon modelinde,uygulanan Aβ peptit monomerlerinin konformasyonel değişimlerinin hücre canlılığı üzerineetkisi değerlendirildi.Nöron modeli olarak kullanılan sıçan feokromasitoma (PC-12) ve insan nöroblastoma(SHSY-5Y) hücre hatları Aβ25-35 peptit (20µM/40µM), P (0.25-100µM) ve PS (0.25-100µM)ile 24, 48 ve 72 saat muamele edildi. Aβ'nın monomerik yapıdan fibriler yapıya değişimi37ºC'de 72 saat süresince inkübasyonu ile sağlandı. Farklı konformasyonel özelliklere sahipAβ'nın, P ve PS'nin hücre canlılığına etkisi doz ve zaman bağımlı olarak MTT indirgenmeyöntemi ve ters-faz ışık mikroskobik incelemeyle değerlendirildi. Aβ25-35 peptit fragmanınınkonformasyonel değişimleri elektron mikroskobik olarak belirlendi.20µM Aβ25-35'in ön inkübasyon işlemi olmaksızın monomerik yapıda SHSY-5Y'lere verilmesi72.saate kadar hücre canlılığını etkilemezken PC-12'lerde canlılığı 24.saatten sonra anlamlışekilde azalttı. Aβ'nın ancak 40µM dozda fibriler yapıda iken 72saat süresinceuygulanmasının SHSY-5Y'lerde anlamlı toksik etki gösterdiği belirlendi.72.saatin sonunda Pve PS'nin 1µM ve üstü dozlarda uygulanmasının PC-12'lerde canlılığı kontrol grubunun %40'ıolacak şekilde azalttığı; SHSY-5Y'lerde ise ancak 5µM ve üstü dozlarda toksik etkigöstermeye başladığı belirlendi. Her iki hücre hattında 0.5µM düzeyinde P uygulanmasınınAβ ile oluşturulan toksisiteye karşı koruyucu etkisi olduğu gösterildi. Çalışmamızın bulgularıAβ peptidin yapısal değişimlerinin hücre canlılığını etkileyen bir faktör olduğunu ve nöroaktifsteroid düzey değişimlerinin nörodejenerasyon oluşumunda rolü olabileceğinidüşündürmüştür.

Abstract

Amyloid beta (Aβ) induced toxicity is an invitro neural degeneration model for Alzheimer'sdisease. Pregnenolone (P), pregnenolone sulphate (PS) are the major steroids produced in theneural tissue and are also called neuroactive steroids because of their behaviors likeneurotransmitter. The synthesis of steroids in neural tissue could be changed by ischemia,oxidative stress or neurotoxicity namely induced by Aβ, glutamate. The potential roles of Pand PS in vital neuronal functions and in Aβ peptide toxicity are not clearly identified. Thiswork aims to investigate the effects of P, PS and Aβ on the cell viability using two separatecell lines. The effects of conformational changes in Aβ were also evaluated.Rat pheochromocytoma (PC-12) and human neuroblastoma (SHSY-5Y) cell lines weretreated with Aβ25-35 (20/40µM) and variable concentrations of P and PS ranging from 0.25µMto 100µM. The cell viability was evaluated with MTT reduction assay and reverse-phasemicroscopy. The conformational changes of Aβ peptides were induced with 72 hoursincubation at 37ºC. The structural changes of Aβ were evaluated with electron microscopy.The treatment with 20µM Aβ25-35 monomers did not affect SHSY-5Y cell viability, thesignificant toxicity was observed only with 40µM Aβ25-35 fibrils after 72hours. However thesignificant reduction in PC-12cell viability was obtained by the treatment with 20µM Aβ25-35monomers. In PC-12 cell lines, the viability was decreased to 40% of control group by thetreatment with 1µM and higher concentrations of P and PS separately. This same effect wasobserved in SHSY-5Y cells with 5µM and higher concentrations of steroids.0.5µM P showedprotective effect against Aβ25-35 induced toxicity in both cell lines. Our results suggest that Aβfibrillogenesis and neuroactive steroid may play causal roles in the neurodegenerativeprocesses.