Isolation of Synaptic Vesicles From Rat Brain

Özet

Giriş: Sinaptik veziküller (SVs) presnaptik uçlarda nörotransmitterleri depolayan vesalınımını sağlayan temel organellerdir. İzole edilip saflandırılan SVs biyokimyasal, yapısal,ve işlevsel özelliklerini araştırmak üzere kullanılabilirler ve nörotransmisyon oluşumunuaçıklamaya yardımcı olurlar. Bu makale saflaştırılmış ve işlevsel SVs kazanımını sağlayan biryöntem tanımlamaktadır.Yöntem: SVs Sprague-Dawley sıçanlarının beyinlerinden differansiyel ve yoğunluk-gradientsantrifugasyon kullanılarak izole edildiler. Morfolojileri elektron mikroskobide gözlemlendi.SC fraksiyonundaki protein miktarı Bradford ölçümü ile belirlendi. Spesifik SVsimmünoizolasyon ve manyetik tesbihler kullanılarak izole edildiler ve immünoblot ölçümükullanılarak SV işaretleyicilerinin seviyeleri tayin edildi. SV glutamat alımı ışınetkinizleyicilerle sızıntı ölçümü ile değerlendirildi.Sonuçlar: Yirmiiki gram hipokampal ve serebral korteks dokusundan toplam olarak 10 mgSV protein purifiye edildi. Saflaştırılmış bu SVs homojen ufak küresel veziküller tarzındayaklaşık 40nm çapında elektron mikroskobu ile değerlendirildi ve SV protein 2 (SV2),veziküler glutamat taşıyıcı 1 (VGLUT1), ve VGLUT2 den zengin ancak VGLUT3den fakirolarak saptandı. İmmünoadsorbsiyonla kazanılan SV2-spesifik SVs L-glutamat alımınıyaklaşık %83 oranında başardılar. Bir VGLUT inhibitörü olan Rose Bengal, SV2-spesifikSVs L-glutamat alınımını önledi.Yargı: Yapılarını koruyarak primer in vivo işlevlerini gerçekleştirmek üzere bu çalışmasaflaştırılmış SVs eldesi için başarılı bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu SVs, SVkompozisyonunu ve işlevini, nörotransmitter salınım olayını santral sinir sistemi ilaçlarınınterapötik değerlendirmesini anlamada kullanılabilirler.

Abstract

Objective: Synaptic vesicles (SVs) are essential organelles that store and releaseneurotransmitters within presynaptic terminals. Isolated and purified SVs can be used toinvestigate their biochemical, structural, and functional characteristics, to elucidate theneurotransmission process. This paper describes a method for obtaining purified andfunctional SVs.Methods: SVs were isolated from the brains of Sprague Dawley rats using differential anddensity-gradient centrifugation. Their morphology was observed with electron microscopy.The amount of protein in the SV fraction was determined by the Bradford assay. Specific SVswere purified using magnetic beads and immunoisolation, and immunoblot assays were usedto measure levels of SV markers. SV glutamate uptake was assayed by radiotracer effluxassays.Results: A total of 10 mg SV protein was purified from 22 g of hippocampal and cerebralcortex tissue. The purified SVs were homogenous small spherical vesicles with a diameter of~40 nm as assessed with electron microscopy, and they were rich in the protein SV protein 2(SV2), vesicular glutamate transporter 1 (VGLUT1), and VGLUT2, but not VGLUT3. TheSV2-specific SVs obtained by immunoadsorption with nearly 83% yield could uptake L- glutamate. Rose Bengal, a VGLUT inhibitor, prevented SV2-specific SVs from taking-up L- glutamate.Conclusions: This study describes a successful method for obtaining purified SVs thatretained their structure and ability to perform their primary in vivo functions. These SVs canbe used to understand SV composition and function, and the process of neurotransmitterrelease, and to evaluate therapeutic drugs for nervous system diseases.