Assesment of protein gene product (Pgp9.5) enzyme activity against potential peptide substrate

Pgp9.5 enzim aktivitesinin potansiyel peptid substratlarına karşı değerlendirilmesi

Özet

Amaç. PGP 9.5, kronik dejeneratif hastalıklarda özellikle ubiquitin ile işaretlenmiş inkluzyonlarda bulunan, immunohistokimyasal boyamalarla da gösterilen norona spesifik ubiquitin karboksi terminal hidroksilazdır. Demanslı hastaların post-mortem beyin kesitlerinde patolojik olarak görülen norofibriler düğümler, kortikal Lewy body, Rosenthal fiber ve Pick body’lerde PGP 9.5’in varlığı immunohistokimyasal boyama ile gösterildi. Alzheimer hastalığında yaygın olarak görülen norofibriler düğümler senil plakları çevreleyen nöronlar ile birlikte boyandı. PGP 9.5, ubiquitin karboksi terminal etil esteraz aktivitesi göstermişken, onun substrata spesifikliği açık değildir. Bu yüzden amacımız PGP 9.5’i pürifiye etmek ve enzimin hücre içinde yıkılacak proteinlere bağlanan ubiquitinlerin serbest hale gelmesindeki rolünü göstermektir. Gereç ve Yöntem. Ubiquitin, ubiquitin karboksi terminal hidrolaz ile konjugatlarından ayrılır, bunlardan biri de PGP 9.5’tir. PGP 9.5 insan post-mortem beyin dokusunda homojenize edilip purifiye edildi. Protein sekansı yapılarak doğruluğu belirlendi. Potansiyel peptid substratlar PGP 9.5 ile inkube edildi ve HPLC ile analiz edildi.Bulgular. Dallanmış poliubiquitin lerin PGP9.5 enzimi için substrat olmadığı fakat enzimin düz zincir şeklinde bağlanmış ubiquitinleri substrat olarak tanıdığı gösterilmiştir.Sonuç. Hücre içindeki anormal proteinlerin ubiquitine bağımlı yıkımında ubiquitinin anormal proteine bağlanıp işaretleme şekli önemli olup, sadece düz sıralı ubiquitinler PGP 9.5 enzimi tarafından serbest ubiquitinlere ayrılmaktadır. Enzimin bu aktivitesinin fizyolojik önemi tam açık değildir.

Abstract

Objective. PGP9.5 is a human neuron specific ubiquitin carboxylterminal hydolase that has been shown by immunuhistochemistry to be present selectively in ubiquitinated inclusions in chronic human degenerative disease. Paraffin sections known to contain ubiquitinprotein conjugate immunureactivity in neurofibrillary tangles (NFT), cortical Lewy bodies, Rosenthal fibres and in Pick bodies were immunostained with PGP9.5. In Alzheimer's disease loosely arranged globose-type neurofibrillary tangles (NFTs) were immunostained together with neuritis surrounding senile plaques (SP). While PGP9.5 has been demonstrated to have ubiquitin carboxy-terminal ethyl esterase activity, there has not been clear identification of its substrate specificity. The main aim was, therefore, to purify PGP9.5 and study its carboxyl-terminal hydrolase activity using, as substrates, synthetic peptides that were chosen to reflect the known possible functions of the enzyme. Materials and Methods. Ubiquitin is cleaved from conjugates by ubiquitin carboxyl-terminal hydrolases, one of which is protein gene product 9.5 (PGP 9.5). PGP9.5 was purified to homogeneity from human post-mortem brain tissue, its identity confirmed by protein sequence determination. Potential peptide substrates were incubated with PGP 9.5 and assayed by HPLCResults. Overlap region of ubiquitin in branched gene products were not substrates. Evidence was obtained for cleavage of linearly-conjugated polyubiquitin.Conclusion. Degradation of abnormal proteins by ubiquitin system depends on binding structure of ubiquitins. It has been shown that only linear ubiquitis are substrate for the PGP 9.5. The importance of it is not well understood.