P1 Transdüksiyon Yöntemi ile Birden Fazla Gen Bakımından Mutant Olan Escherichia coli Suşlarının Elde Edilmesi

P1 Transduction Method to Construct Escherichia coli Mutant Strains Lacking More Than One Gene

Özet

Bakterilerde gen fonksiyonlarının keşfedilmesi ve fenotipik çalışmalarının yapılabilmesi için mutant suşlarınoluşturulması gerekmektedir. Bazı durumlarda, birden fazla gen açısından mutant olan suşlar oluşturulmalıdırçünkü bazı spesifik aktiviteler birden fazla gen tarafından kodlanmaktadır. P1 fajı, Escherichia coli'de, ikili, üçlüveya çoklu mutantların oluşturulmasında başvurulan, genelleştirilmiş bir transdüksiyon fajıdır. Bu faj, gelişimisırasında, E. coli kromozomunun parçalarını (her bir partikülde genomun yaklaşık % 2'si olmak üzere), rastgelebir şekilde faj kafasına paketleyebilmektedir. E. coli DNA’sını içeren fajlar, içerdikleri DNA parçalarını, alıcıbakteri hücrelerine enjekte edebilmektedir. Verici ve alıcı DNA bölgeleri arasındaki benzerlik ve seçici bir belirteçyardımıyla, transdüktanlar’ın elde edilmesi mümkün olmaktadır. Transdüksiyon için tercihen, P1 fajının, virülanbir türevi (P1vir) kullanılmaktadır, çünkü bu form, bakterinin genomuna entegre olamamaktadır. Fajın buözelliğinin kullanılmasıyla geliştirilen tekniklerden birisi, P1 transdüksiyon tekniği olarak adlandırılmaktadır.Rekombinasyon teknolojisinde kullanılan bu teknik, E. coli genomuna ait DNA parçalarının, farklı suşlar arasındataşınmasını sağlamaktadır. Bu çalışmada, optimize ettiğimiz P1 transdüksiyon metodolojisinin, deneysel akış veyeterli detaylarla birlikte, Türk bilim camiasına, ana dilimizde sunulması amaçlanmıştır. Bunun için, KEIOkoleksiyonundan elde edilen dört adet tekli gen mutantları kullanılmıştır. İlk olarak, kanamisin (Kan) duyarlı biralıcı suş oluşturmak için, her bir mutant suştan, Kan gen kasetleri çıkarılmıştır. KanR kasetlerine sahip diğer dörtadet KEIO mutant suşu, donör suşlar olarak kullanılmış ve P1 fajı bu suşlar ile kültür edilerek, lizatlar eldeedilmiştir. Bu lizatlar ve alıcı suşlar daha sonra, lizatlardaki fajların içerdikleri DNA parçalarını, alıcı suşgenomuna entegre edebilmesi için, transdüksiyona tabii tutulmuştur. Kanamisin ile seleksiyon sonucu, yeni mutantsuşlar olan ikili mutantlar elde edilmiştir. Sonuçta, isimleri tsgAugpA, yhdTompA, ugpAmdtG ve aroGmalFolan, dört adet ikili mutant oluşturulmuştur. Deneysel akıştaki ilgili protokoller ve sonuçlara ait detaylar sunulmuşve tartışılmıştır.

Abstract

Assigning gene functions and performing phenotypic studies of the bacteria require the construction of specific mutants that at times should lack more than one gene due to the redundancy of particular gene activities. P1 phage is a generalized transducing phage that can be used in constructing double, triple or multiple mutants of Escherichia coli. This phage is able to mistakenly package random fragments of E. coli chromosome (~2 % of the genome into each particle) into the phage head during phage development. The phages with E. coli DNA can inject that DNA into recipient cells. Given homology between donor and recipient, and a selectable marker, transductants can be obtained. For transduction, a virulent derivative of phage P1 is preferably used because this form cannot integrate into the bacterial genome. The virulent phage can only develop using the lytic mode of development and produces phage progeny upon lysis of the host cell. This technique is based on recombinationtechnology, allowing the DNA fragments of the E. coli genome to be transported among the strains.In this study, we optimized the P1 transduction methodology, which we aim to present to the Turkish scientific community in the native language with the experimental flow and sufficient details. For this reason, a number of four single gene mutants obtained from the KEIO collection were used. First, kanamycine (Kan) gene cassettes were removed from each mutant strain to create a recipient strain that is kan sensitive. The other four KEIO mutant strains with KanR cassettes were used as the donor strains and P1 phage were cultured with these strains and the lysates were obtained. These lysates and recipient strains were then transduced to integrate the DNA fragments of the lysates into the recipient strain genome. Upon selection with kanamycine, new mutant strains, double mutants are obtained. As a result, four double mutants namely tsgAugpA, yhdTompA, ugpAmdtG and aroGmalF were obtained and the details pertaining to the protocols and results are presented and discussed.