NPM1 Mutation Analysis in Acute Myeloid Leukemia: Comparison of Three Techniques - Sanger Sequencing, Pyrosequencing, and Real-Time Polymerase Chain Reaction

Akut Miyeloid Lösemide NPM1 Mutasyon Analizi: Üç Tekniğin Karşılaştırılması/Sanger Dizileme, Pirodizileme ve Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Dushyant KUMAR,Anurag MEHTA,Manoj Kumar PANİGRAHİ,Sukanta NATH,Kandarpa Kumar SAİKİA

Özet

Amaç: Nükleofosmin-1 (NPM1) mutasyonları tanı anında orta risk akut miyeloid lösemi (AML) hastalarında prognostik öneme sahiptir. Hindistan'da, yeni teşhis normal sitogenetiğe sahip AML (CN-AML) hastalarının yaklaşık %30'u NPM1 pozitiftir. Bu çalışmada periferik kan ve kemik iliği örneklerinde NPM1 mutasyonu saptamada kullanılan üç moleküler tekniğin etkinliğini karşılaştırdık. Gereç ve Yöntemler: Tek merkezli bu kohortta, 165 CN-AML kemik iliği/periferik kan örneklerinde NPM1 mutasyon analizi yapıldı. CNAML örneklerinin yaklaşık %30'unda NPM1 mutasyonu saptandı. Mutasyonun taranmasında üç yöntem karşılaştırıldı: Sanger dizileme, pirodizileme, gerçek-zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR). Bulgular: Tüm CN-AML olgularının 52'sinde (%31,51) NPM1 exon12 mutasyonları gözlendi. Sanger dizileme, pirodizileme ve gerçek zamanlı PCR'nin duyarlılıkları sırasıyla %80, %90 ve %95 iken, özgünlükleri %95, %100 ve %100'dü. Mutasyonun saptanmasında minimum limit Sanger dizileme yöntemi için %20-%30, pirodizilemede %1-5, ve gerçek-zamanlı PCR için %0,1-%1 idi. Sonuç: Referans yöntemi olan dizileme yöntemi, en düşük duyarlılığa sahiptir ve bazen yorumlaması güçtür. Gerçek-zamanlı PCR mutasyon saptamada yüksek duyarlılığa sahip bir yöntemdir fakat özel mutasyon tipleri için sınırlıdır. Çalışmamızda, pirodizileme yönteminin kolay yorumlanması ve Sanger dizileme yönteminden daha az zaman harcanan işlem olması esasına dayanarak NPM1 mutasyonun saptanmasında en uygun teknik olduğu sonucuna varılmıştır.

Abstract

Amaç: Nükleofosmin-1 (NPM1) mutasyonları tanı anında orta risk akut miyeloid lösemi (AML) hastalarında prognostik öneme sahiptir. Hindistan’da, yeni teşhis normal sitogenetiğe sahip AML (CN-AML) hastalarının yaklaşık %30’u NPM1 pozitiftir. Bu çalışmada periferik kan ve kemik iliği örneklerinde NPM1 mutasyonu saptamada kullanılan üç moleküler tekniğin etkinliğini karşılaştırdık. Gereç ve Yöntemler: Tek merkezli bu kohortta, 165 CN-AML kemik iliği/periferik kan örneklerinde NPM1 mutasyon analizi yapıldı. CNAML örneklerinin yaklaşık %30’unda NPM1 mutasyonu saptandı. Mutasyonun taranmasında üç yöntem karşılaştırıldı: Sanger dizileme, pirodizileme, gerçek-zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR). Bulgular: Tüm CN-AML olgularının 52’sinde (%31,51) NPM1 exon12 mutasyonları gözlendi. Sanger dizileme, pirodizileme ve gerçek zamanlı PCR’nin duyarlılıkları sırasıyla %80, %90 ve %95 iken, özgünlükleri %95, %100 ve %100’dü. Mutasyonun saptanmasında minimum limit Sanger dizileme yöntemi için %20-%30, pirodizilemede %1-5, ve gerçek-zamanlı PCR için %0,1-%1 idi. Sonuç: Referans yöntemi olan dizileme yöntemi, en düşük duyarlılığa sahiptir ve bazen yorumlaması güçtür. Gerçek-zamanlı PCR mutasyon saptamada yüksek duyarlılığa sahip bir yöntemdir fakat özel mutasyon tipleri için sınırlıdır. Çalışmamızda, pirodizileme yönteminin kolay yorumlanması ve Sanger dizileme yönteminden daha az zaman harcanan işlem olması esasına dayanarak NPM1 mutasyonun saptanmasında en uygun teknik olduğu sonucuna varılmıştır.