Molecular detection of Mycobacterium tuberculosis in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues and biopsies of gastrointestinal specimens using real-time polymerase chain reaction system

Formalinde fikse edilmiş, parafine gömülmüş gastrointestinal dokularda ve biyopsilerde gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sistemi kullanarak M. tuberculosis'in moleküler olarak tespit edilmesi

Pradyumna Kumar MISHRA,Venkata Raghuram GORANTLA,Arpit BHARGAVA,Subodh VARSHNEY,Purushottam VASHISTHA,Kewal Krishan MAUDAR

Özet

Formalinde fikse edilmiş, parafine gömülmüş gastrointestinal dokularda ve biyopsilerde gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonlarını (GZ-PZR) kullanarak M. tuberculosis'in moleküler olarak tespit edilmesi amaçlanmıştır. Yöntem: Çalışmaya M. tuberculosis hikayesi olmayan 24 hasta (Grup A; kontrol), tüberküloz hikayesi olan 28 hasta (Grup B) ve kültür veya ARB negatif olan ancak tüberküloz kliniği olan 50 hastadan (Grup C) alınan gastrointestinal doku örnekleri dahil edilmiştir. Doku örnekleri Bhopal Memorial Hastanesi ve Araştırma Merkezinin medikal ve cerrahi gastroenteroloji kliniklerinde izlenen hastalardan elde edilmiştir. DNA ekstraksiyonu DNeasy Blood & Tissue kiti (QIAGEN, Almanya) ile, polimeraz zincir reaksiyonu işlemleri ise mycobakterinin 159 bazlık özgül bölgesine bağlanan şoresan rezonans transfer hibridizasyon problarının (Roche Molecular Diagnostics, ABD) kullanıldığı Roche Light Cycler 2.0 sistemi ile gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar: Grup A'dan alınan tüm örnekler (n=24) negatif bulundu. Buna karşılık grup B'de çalışılan 28 hastanın 27'sinde pozitiflik tespit edildi. Grup C'de 50 hastanın 18'inde (%36) polimeraz zincir reaksiyonu pozitişik bulundu. Genel olarak polimeraz zincir reaksiyonunun pozitif prediktif değeri %100, negatif prediktif değeri %96,9 bulundu. Tartışma: Çalışmamızın sonuçları ortaya koymuştur ki, floresan enerji transfer problerı kullanılarak gerçekleştirilen polimeraz zincir reaksiyonu işlemi, gastrointestinal sistemden alınmış formalin ile fikse edilmiş ve parafine gömülmüş doku örneklerinde M. Tuberculosis DNA'sının tespit edilmesinde oldukça duyarlı bir yöntemdir.

Abstract

We aimed to perform the molecular detection of Mycobacterium tuberculosis in formalin-fixed, paraffinembedded tissues and biopsies of gastrointestinal specimens using real-time polymerase chain reaction system. Methods: The study included three groups: (A) control (n=24), with no previous signs of M. tuberculosis complex (MTBC), (B) patients (n=28) with known TB origin and (C) patients (n=50) with clinical and histopathological signs of TB but who were cultureand acid-fast bacilli (AFB)-negative. The samples were obtained from the Medical and Surgical Gastroenterology Departments of Bhopal Memorial Hospital and Research Centre. We extracted DNA using DNeasy Blood & Tissue kit (QIAGEN, Germany) and performed realtime assay using Roche LightCycler 2.0 with fluorescence resonance energy transfer (FRET) hybridization probes obtained from Roche Molecular Diagnostics (USA) for the specific amplification of the 159 bp region of the mycobacterium genome. Results: All the samples (n=24) of Group A were found to be negative, while in Group B, 27 out of the 28 cases studied were found to be positive by LightCycler real-time polymerase chain reaction (LC PCR). In Group C, 18 out of the 50 cases studied were found to be positive, showing a positivity of 36%. The overall positive and negative predictive values of the test for clinical TB (Group C) were 100% and 96.9%, respectively. Conclusions: Results of our investigation demonstrated that the real-time detection technology using FRET probes has much higher sensitivity for the detection of MTBC DNA in tissue biopsy samples and formalin-fixed paraffin-embedded surgically resected tissues of the gastrointestinal tract.