Development and Validation of HPLC-UV Method for the Determination of Diclofenac in Human Plasma with Application to a Pharmacokinetic Study

Diklofenak’ın İnsan Plazmasından HPLC-UV ile Tayin Yöntemi Geliştirilmesi ve Validasyonu ile Farmakokinetik Çalışmaya Uygulanması

Gülsüm GÜL ARISOY,Emrah DURAL,Görkem MERGEN,Mustafa ARISOY,Gülin Güvendik,Tülin SÖYLEMEZOĞLU

Özet

A simple, rapid and reliable high performance liquid chromatography method (HPLC) with ultraviolet detection (UV) was developed and validatedaccording to ICH guidelines, for quantitative analysis and therapeutic drug monitoring of diclofenac sodium (DS) in human plasma. Plasma samples (0.7mL) were acid hydrolysis by 100 µL, 1 M hydrochloric acid. Analytes were concentrated from plasma by liquid–liquid extraction with 2 mL ethyl acetateby repeated twice, which allows to obtain good extraction yields (98.75%-99.32%). The separation was achieved by employing C18 analytical column(3.5 µm particle size, 150 mmx3.9 mm I.D.) under isocratic conditions using acetonitrile and NaH2PO4 mixture (42.5:57.5, v/v) as mobile phase (pH:3.16) flow rate of 1.5 mL/min. Naproxen (3 µg/mL) was used as an internal standard (IS). The DS and IS were detected at 281 nm and eluted at 2.6 and6.2 min, respectively. Total run time was 7 min. Method showed linearity with very good determination coefficients (r2=0.999), over the concentrationrange of 50 - 1600 ng/mL. Limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were 8.95 ng/mL and 27.12 ng/mL, respectively. Intra-day precisionand accuracy were between 0.93-5.27; 1.74-9.81, respectively. Inter-day precision and accuracy were between 2.71-6.64; 2.03-9.16, respectively. Thismethod was successfully applied for determination of DS plasma concentrations during a pharmacokinetic study in healthy volunteers (n=12) after anoral administration of Voltaren® 75 mg/tablet and remarkable variations in DS levels were observed. In our study, on the contrary to equivalent dosesof DS, the observed significant differences in plasma levels of DS, on 2nd, 4th and 6th hours, can be explained by pharmacokinetic differences, that arisefrom mainly polymorphisms of CYP2C9 and CYP3A4, which are major enzymes responsible for DS metabolism.

Abstract

Diklofenak sodyumun (DS) insan plazmasında kantitatif analizleri ve terapötik ilaç izlemi için, basit, hızlı ve güvenilir bir ultraviyole dedektörlü yüksek performanslı sıvı kromatografisi (YPSK-UV) metodu geliştirildi ve ICH kurallarına göre valide edildi. Plazma örnekleri (0.7 mL) 100 µL, 1 M hidroklorik asitle hidroliz edildi. Analitler plazmadan iyi ekstraksiyon verimi (%98.75-%99.32) sağlayan sıvı-sıvı ekstraksiyonu metodu ile 2 mL etil asetatla iki tekrar ile elde edildi. Ayrım izokratik şartlar altında C18 analitik kolon (3.5 µm partikül büyüklüğü, 150 mmx3.9 mm I.D.), mobil faz asetonitril ve NaH2PO4 (42.5:57.5, v/v) karışımı (pH 3.16), akış hızı 1.5 mL/dk ile gerçekleştirildi. Naproksen (3 µg/mL) iç standart (İS) olarak kullanıldı. DS ve İS 281 nm’de ve sırasıyla 2.6 ve 6.2 dakikalarda tespit edildi. Toplam analiz süresi 7 dakika idi. Metot 50 - 1600 ng/mL konsantrasyon aralığında çok iyi bir belirlenme katsayısı ile (r2=0.999) doğrusallık gösterdi. Gözlenebilme sınırı ve tayin sınırı sırasıyla 8.95 ng/mL ve 27.12 ng/mL idi. Gün içi kesinlik ve doğruluk sırasıyla 0.93-5.27; 1.74-9.81 aralığında idi. Günler arası kesinlik ve doğruluk ise sırasıyla 2.71-6.64; 2.03-9.16 aralığında idi. Bu metot sağlıklı gönüllülerin (n=12) tek doz oral Voltaren® 75 mg/tablet alımı ile farmakokinetik çalışma süresince DS plazma konsantrasyonlarının belirlenmesi için başarıyla uygulandı ve DS düzeylerinde dikkate değer varyasyonlar gözlendi. Çalışmamızda DS’nin eşit dozlarına karşın, 2., 4. ve 6. saatlerdeki plazma düzeylerinde gözlenen anlamlı farklılıklar, özellikle DS metabolizmasından sorumlu majör enzimler olan CYP2C9 ve CYP3A4 polimorfizmlerinden kaynaklanabilecek farmakokinetik farklılıklarla açıklanabilir.