Anti-Angiogenic Activity of Flunarizine by In Ovo, In Vitro, and In Vivo Assays

In Ovo, In Vitro ve In Vivo Günlüklerinden Flunarizinin Anti-Anjiyojenik Aktivitesi

Özet

Objectives: The involvement of T-type calcium channels in cell proliferation and the role of sodium channels in cell migration have been extensivelystudied in angiogenesis. In the present study, flunarizine, a dual sodium/calcium channel blocker; was selected to evaluate its anti-angiogenicpotential. This can be therapeutically beneficial in diseases caused by pathologically excessive angiogenesis.Materials and Methods: The anti-angiogenic activity of ion channel blocker was screened by chick chorioallantoic membrane assay (in ovo), rataortic ring assay, endothelial cell proliferation assay, transwell migration assay, Matrigel cord-like morphogenesis assay (in vitro), and spongeimplantation method (in vivo). The anti-angiogenic activity of the test drug was compared with the standard anti-angiogenic drug bevacizumab and,in addition, the test responses were compared with the angiogenic factor vascular endothelial growth factor at a maximal concentration of 500 pM.Results: All the groups were compared with the control group using one-way ANOVA, followed by a post hoc test, Dunnett’s test, to compare themean of all the groups with the control mean. In the chick chorioallantoic membrane assay, the number of branching points and angiogenic scorewere evaluated and significant results were observed at 10-5 M and 10-4 M. In the aortic ring assay a reduction in the area of sprouts was observedwith 5-10 µM and significant reductions in the weight of sponges, number of blood vessels formed, and hemoglobin content were observed at allthree tested concentrations of flunarizine in the sponge implantation method. In the studies on human umbilical vein endothelial cells the test drug(1-100 nM) showed significant inhibition of proliferation and migration and a decrease in the network length of cord-like tubes in a dose-dependentmanner.Conclusion: Flunarizine has significant anti-angiogenic action by inhibiting cell proliferation, migration, and cord-like tube formation, which resultedfrom blocking of the T-type calcium and sodium channels. Further studies on the structural modifications of flunarizine for repurposing this ionchannel modulator will lead to treatment of the diseases due to excessive angiogenesis from the root cause.

Abstract

Amaç: Hücre proliferasyonunda T-tipi kalsiyum kanallarının tutulumu ve hücre göçü içindeki sodyum kanallarının rolü anjiyogenezde kapsamlı olarak incelenmiştir. Bu çalışmada, ikili bir sodyum/kalsiyum kanal blokeri olan flunarizin; anti-anjiyojenik potansiyelini değerlendirmek için seçildi. Bu, patolojik olarak aşırı anjiyogenezin neden olduğu hastalıklarda terapötik olarak yararlı olabilir. Gereç ve Yöntemler: İyon kanalı blokörünün anti-anjiyojenik aktivitesi, civciv korioallantoik membran deneyi (in ovo), sıçan aortik halka deneyi, endotelyal hücre proliferasyon analizi, transwell migrasyon deneyi, Matrigel kord benzeri morfojenez deneyi (in vitro) ve sünger implantasyonu ile tarandı. Yöntem (in vivo). Test ilacının anti-anjiyogenik aktivitesi standart anti-anjiyojenik ilaç olan bevacizumab ile karşılaştırıldı ve buna ek olarak, test yanıtları, 500 mM’lik bir maksimum konsantrasyonda anjiyojenik faktör vasküler endotel büyüme faktörü ile karşılaştırıldı. Bulgular: Tüm gruplar kontrol grubu ile tek yönlü ANOVA kullanılarak ve post hoc testi ile karşılaştırıldı, Dunnett testi ile tüm grupların ortalamaları kontrol ortalaması ile karşılaştırıldı. Chick chorioallantoic membran testinde dallanma noktaları ve anjiyojenik skorlar değerlendirildi ve 10-5 M ve 10-4 M’de anlamlı sonuçlar gözlendi. Aort halkası analizinde, filiz alanında 5-10 µM azalma gözlendi ve sünger implantasyon yönteminde test edilen üç flunarizin konsantrasyonunda sünger ağırlığında anlamlı bir azalma, kan damarlarının sayısı ve hemoglobin içeriği gözlendi. İnsan umbilikal ven endotelyal hücreleri üzerindeki çalışmalarda, test ilacı (1-100 nM), proliferasyonun önemli ölçüde engellenmesini, doza ve kordon benzeri tüplerin ağ uzunluğunun doza bağımlı bir şekilde azaldığını gösterdi. Sonuç: Flunarizin, T-tipi kalsiyum ve sodyum kanallarını bloke ederek hücre proliferasyonu, migrasyon ve kord benzeri tüp oluşumunu inhibe ederek önemli anti-anjiyogenik etkiye sahiptir. Flunarizinin bu iyon kanal modülatörünü yeniden üretmek için yapısal modifikasyonları ile ilgili daha ileri çalışmalar, kök nedeninden aşırı anjiyogenezden kaynaklanan hastalıkları tedavi edebilecektir.