Arı Ürünlerinin (Bal, Propolis) Leishmania tropica Promastigotları Üzerine Antileyşmanyal Etkilerinin Araştırılması

Investigation of Anti-leishmanial Effects of Bee Products (Honey, Propolis) on Leishmania tropica Promastigotes

Özet

Bu çalışma, kutanöz leyşmanyazis etkeni Leishmania tropica promastigotları kullanılarak arı ürünlerinin(bal, propolis) antileyşmanyal etkilerinin in vitro kültür ortamında araştırılması amacıyla yapılmıştır. Çalışmada kullanılan bal (çam, çiçek ve kestane) ve propolisin in vitro antileyşmanyal etkinliği mikrodilüsyonyöntemi kullanılarak değerlendirilmiştir. Arı ürünlerinden olan bal %10 “fetal calf serum (FCS)” içerenRPMI besiyeri ile çözdürülmüş ve aynı besiyeri içerisinde sulandırılmış olup, 62.5-1000 mg/ml arasındakikonsantrasyonlarda seri dilüsyonları hazırlanmıştır. Propolis ise etil alkol ile çözdürülmüş, hazırlanmış olanbu konsantrasyonlarda alkol oranının %50’den fazla olmasından ve bu oranın parazit gelişimini olumsuzetkileyeceğini düşündüğümüzden dolayı, tüm bu konsantrasyonlardan yalnız 2.5 μl kullanılarak %10 FCSiçeren RPMI besiyeri içerisinde sulandırılmış ve ardından 50-800 μg/ml arasındaki konsantrasyonlardaseri dilüsyonları hazırlanmıştır. Hazırlanan dilüsyonların üzerine, kuyucuklardaki son konsantrasyonları 1x 106 promastigot/ml olacak şekilde promastigot süspansiyonu ilave edilmiş ardından 26°C’lik etüvde 24ve 48 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyondan sonra promastigotlar morfoloji, hareketlilik ve canlı parazityoğunluğu yönünden mikroskobik olarak, hücre canlılığı ise MTS yöntemi ile incelenerek %50 inhibitörkonsantrasyonları (IC50) kontrol grupları ile karşılaştırılarak belirlenmiştir. Propolisin (50, 100, 200, 400 ve800 μg/ml) ve balların (62.5, 125, 250, 500 ve 1000 mg/ml) beş farklı konsantrasyonu promastigotlarüzerine antileyşmanyal aktivitesi in vitro ortamda değerlendirilmiş ve mikroskobik incelemelerde çambalının 62.5 mg/ml, çiçek balının 250 mg/ml, kestane balının ise 125 mg/ml konsantrasyonlarından itibaren antileyşmanyal etkinlik gösterdiği, çam balının promastigotlar üzerine daha etkin olduğu (p< 0.05),propolisin ise 100 μg/ml konsantrasyonundan itibaren etki ettiği gözlemlenmiştir. Propolisin çok düşükkonsantrasyonlarının özellikle parazitlerin morfolojik yapılarında değişmelere sebep olduğu ve bu konuda diğer arı ürünlerinden daha etkin olduğu belirlenmiştir. L.tropica promastigot hücre kültürü üzerineuygulanan çam balı (IC50= 109.28 mg/ml), çiçek balı (IC50= 248.07 mg/ml), kestane balı (IC50= 147.65mg/ml) ve propolisin (IC50= 82.98 μg/ml) hücre çoğalmasını engellediği (p< 0.05) ve IC50 değerlerininzamana bağlı olarak azaldığı MTS yöntemiyle tespit edilmiştir. Yapılan bu çalışmada çam balı, çiçek balı,kestane balı ve propolisin çeşitli konsantrasyonlarının L.tropica promastigotları üzerine antileyşmanyaletkinlik gösterdiği tespit edilmiş, bunlardan çam balının 48 saatlik inkübasyon süresi sonunda promastigotlar üzerinde daha etkin olduğu, propolisin ise çok düşük konsantrasyonlarında dahi parazitlerin hemmorfolojisinde hem de hücre inhibisyonunda daha etkili olduğu gözlemlenmiştir. Elde edilen bu verilerdoğrultusunda arı ürünlerinin kutanöz leyşmanyazis enfeksiyonlarına karşı alternatif bir tedavi yöntemiolarak kullanılabileceği ve ileri çalışmaların yapılması gerektiği kanısına varılmıştır.

Abstract

This study was aimed to investigate the anti-leishmanial effects of bee products (honey and propolis) by using the causative agent of cutaneous leishmaniasis Leishmania tropica promastigotes, in in vitro culture. In vitro anti-leishmanial efficacy of honey (pine, flower and chestnut) and propolis used in the study were evaluated using the microdilution method. Honey, which is a bee product, was dissolved with RPMI medium containing fetal calf serum (FCS) and diluted in the same medium, and serial dilutions were prepared in concentrations between 62.5-1000 mg/ml. Propolis, on the other hand, was dissolved with ethyl alcohol and only 2.5 μl was used from all these concentrations since the alcohol content was more than 50% in these concentrations prepared and we thought that this rate would negatively effect the parasite development. Then, RPMI containing FCS was diluted in the medium and serial dilutions were prepared at concentrations between 50-800 μg/ml. To the dilutions prepared, the promastigot suspension was added so that their final concentrations in the wells were 1 x 106 promastigot/ml and then the medium was incubated for 24 and 48 hours in 26°C. After the incubation, promastigotes were determined microscopically for morphology, mobility and live parasite density, and cell viability was determined by MTS method and 50% inhibitor concentrations (IC50) were compared with control groups. Anti-leishmanial activity of propolis (50, 100, 200, 400 and 800 μg/ml) and honey (62.5, 125, 250, 500 and 1000 mg/ml) on promastigotes was evaluated in vitro. In microscopic examinations, pine honey showed anti-leishmanial activity starting from 62.5 mg/ml, flower honey 250 mg/ml, and chestnut honey 125 mg/ml, and pine honey was more effective on promastigotes (p< 0.05), and propolis was effective from 100 μg/ml concentration. It has been determined that very low concentrations of propolis caused changes in the morphological structure of the parasites and were more effective than the other bee products. The prevention of cell proliferation and decreasing of the IC50 values according with the time of pine honey (IC50= 109.28 mg/ml), flower honey (IC50= 248.07 mg/ml), chestnut honey (IC50= 147.65 mg/ml) and propolis (IC50= 82.98 μg/ml) applied on L.tropica promastigot cell culture was determined by MTS method. In this study, it was found that various concentrations of pine, flower, chestnut honey and propolis showed anti-leishmanial activity on L. tropica promastigotes. It has been observed that pine honey is more effective on promastigotes after 48 hours of incubation period, and propolis is more effective in both morphology and cell inhibition of the parasites even at very low concentrations. It is believed that these data can be used as an alternative treatment method against cutaneous leishmaniasis infections and further studies are required.