Türkiye’den Bildirilen Sars-CoV-2 İzolatlarında RT-PCR Primer/Prob Bağlanma Bölgelerindeki Nükleotit Değişimlerinin Analizi

Analysis of Nucleotide Changes in RT-PCR Primer/Probe Binding Regions in SARS-CoV-2 Isolates Reported from Turkey

Özet

COVID-19 salgınına neden olan SARS-CoV-2 virüsü, dünya genelinde 55 milyondan fazla olguya ve 1.5 milyona yakın ölüme neden olmuştur. Hastalığın mikrobiyolojik tanısında en geçerli yöntem, gerçek zamanlı revers transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (rRT-PCR) ile viral genomun varlığının saptanmasıdır. Ancak RNA virüslerinin doğası gereği sıkça mutasyona uğramaları, PCR gibi virüsün genetik materyali üzerinde yapılan analizlerin duyarlılığını etkileyebilmektedir. Bu çalışmada, COVID-19 tanısında kullanılan rRT-PCR panellerinin primer-prob bağlanma bölgelerindeki mutasyonların araştırılması amaçlanmıştır. Türkiye’deki COVID-19 olgularından izole edilen ve 17 Mart-14 Eylül 2020 tarihleri arasında, İstanbul (n= 78), Ankara (n= 58), Kars (n= 47), Bursa (n= 2), Adıyaman (n= 2), Erciyes (n= 1) ve Kocaeli (n= 1)’de bulunan merkezlerden GISAID veri tabanına yüklenen 194 adet SARS-CoV-2 tüm genom sekans verileri incelenmiştir. Nükleotit değişimlerinin belirlenmesi için, Türkiye’deki SARS-CoV-2 sekansları, “GenBank” sitesinde bulunan referans genom sekansı (NC_045512.1) ile karşılaştırılmıştır. Oluşturulan veri seti MAFFT programı kullanılarak hizalanmış ve AliView programı kullanılarak, sekansların aynı çerçevede olduğu manuel olarak biçimlendirilerek kontrol edilmiştir. SARS-CoV-2 rRT-PCR tanısında kullanılmak üzere tanımlanmış, yedi farklı enstitüye ait (US CDC, China CDC, Charite CDC, Pasteur, HKU, Thailand, NIID) toplamda 13 adet PCR panelinin, primer-prob bağlanma bölgeleri, AliView programı ile belirlenmiş ve bu bölgelerdeki referans genoma göre değişiklik gösteren nükleotit değişimleri değerlendirilmiştir. Viral genomlardaki sekans çeşitliliği, pozisyonel nükleotit sayısal hesaplayıcı ve entropi hesaplayıcı modüller ile belirlenmiş ve her bir rRT-PCR paneli için, primer-prob bağlanma bölgelerindeki nükleotit ve entropi değişimleri incelenmiştir. On üç farklı primer-prob kombinasyonunun analizi sonucunda, yedi primerprob panelinin hedef bölgelerinde nükleotit değişimleri olduğu belirlenmiştir. Primer-prob bağlanma bölgelerinde nükleotit değişimleri bulunan viral sekanslar incelendiğinde, en sık rastlanan değişimlerin, “China CDC” N-ileri primer ve “US CDC” N3-ileri primer bağlanma bölgelerinde olduğu gözlemlenmiştir. Özellikle tanı testi olarak kullanılacak kitlerin, nükleotit değişimlerinin daha az olduğu bölgelere özgü tasarlanması önemlidir. Nükleotit değişimleri, PCR panellerinin çoğu için, DNA çoğalması açısından kritik olmayabilir ancak testin duyarlılığını etkileyebilme olasılığından ötürü dikkatle izlenmesi gerekmektedir. Tasarlanan bölgenin değişime uğrama riski fazla ise primer-prob bağlanma bölgelerinin sıklıkla kontrol edilmesi ve gerektiğinde güncellenmesi gerekmektedir.

Abstract

The SARS-CoV-2 virus, which caused the COVID-19 epidemic, caused more than 55 million cases and nearly 1.5 million deaths worldwide. For the microbiological diagnosis of the disease, the most valid method is detecting the presence of the viral genome by real-time reverse transcription polymerase chain reaction (rRT-PCR). However, due to the nature of the RNA viruses, frequent mutations may affect the sensitivity of the analyses made on the genetic material of the virus, such as PCR. In this study, we aimed to investigate the mutations in the primer-probe binding regions of the rRT-PCR panels used in COVID-19 diagnosis. SARS-CoV-2 whole genome sequence data (n= 194) isolated from COVID-19 cases in Turkey and uploaded on GISAID database from the centers in İstanbul (n= 78), Ankara (n= 58), Kars (n= 47), Bursa (n= 2), Adıyaman (n= 2), Erciyes (n= 1) and Kocaeli (n= 1) between March 17-September 14, 2020 were analyzed. In order to determine the nucleotide changes, SARS-CoV-2 sequences from Turkey were compared to the reference genome sequence (NC_045512.1) present in “GenBank” website. The constructed data set was aligned using the MAFFT program and was checked manually if the sequences were in the same frame by using the AliView program. Primer-probe binding sites of the thirteen SARS-CoV-2 rRT-PCR panels from seven different institutes (US CDC, China CDC, Charite CDC, Pasteur, HKU, Thailand, NIID) that are being used in COVID-19 diagnosis were evaluated in terms of nucleotide changes within the corresponding regions compared to the reference genome. Sequence diversities in the viral genomes were determined via positional nucleotide numerical calculator and entropy calculator modules and nucleotide and entropy changes in primer-probe binding regions for each rRT-PCR panel were examined. Among thirteen different primer-probe panels, nucleotide changes in the target regions of the seven primer-probe panels were determined. When viral sequences with nucleotide changes in the primer-probe binding regions were examined, the most common changes were observed in the “China CDC” N-forward primer and “US CDC” N3-forward primer binding regions. It is important that the kits to be used as diagnostic tests are designed specific to the regions with less nucleotide changes. Nucleotide changes may not be critical for DNA amplification for most PCR panels, but should be carefully monitored as they may affect the sensitivity of the assay. If the risk of alteration of the designed region is high, the primer - probe binding sites should be checked frequently and updated when necessary.