Hepatit B Virus DNA düzeyi tayini ve eş zamanlı olarak YMDD motif mutasyonu analizi yapan gerçek zamanlı PCR testi

A Real-Time PCR assay for the quantification of hepatitis B virus DNA and concurrent detection of YMDD motif mutations

Özet

Kronik hepatit B enfeksiyonu tedavisi için lamivudin alan hastalarda tedavi takibinde genotipik yöntemler ve viral DNA düzeyi tayini yöntemleri kullanılmakta olup, yoğun bir iş yükü ve uzun bir zaman gerektirmektedir. Bu çalışmada, aynı testte eş zamanlı olarak hepatit B virusu (HBV) DNA düzeyi tayini ve YMDD (tirozin, metionin, aspartat, aspartat) motif mutasyonu analizini gerçekleştirebilecek yeni bir test geliştirilmesi hedeflenmiştir. Test, YMDD motifine özgü hibridizasyon probu temelli gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Rt-PCR) ile gerçekleştirilmiştir. YMDD motifinin belirlenmesi için erime noktası sıcaklığı analizi kullanılmıştır. HBV-DNA düzeyi 1000 ile 3 milyon kopya/ml arasında değişen standart serum örneklerinin (VQC S2220) çalışılmasıyla elde edilen standart eğri kullanılarak viral DNA düzeyi tayin edilmiştir. Geliştirilen yöntem, viral yük tayininde kullanılan kantitatif ticari bir kit (Artus HBV RG PCR; Qiagen, Almanya), ticari “line prob” (INNO-LiPA HBV DR v1.0; Innogenetics, Belçika) kiti ve DNA dizi analizi yöntemleriyle karşılaştırılmıştır. Çalışmada, kronik hepatit B enfeksiyonu olan ve tek başına lamivudin tedavisi alan, HIV ve HCV antijen ve antikorları negatif 20 hastaya (7 kadın, 13 erkek; yaş aralığı: 27-70 yıl) ait 38 serum örneği test edilmiştir. Geliştirilen yöntemin analitik duyarlılık sınırının 200 kopya/ml, dinamik aralığının ise 1 x $10^ 3$ ile 3 x $10^ 7$ kopya/ml arasında olduğu tespit edilmiş; yöntemin PCR etkinliği 1.98 olarak belirlenmiştir. Geliştirilen yöntem ve ticari kit ile elde edilen log10 HBV-DNA kopya/ml değerleri arasında yüksek bir korelasyon saptanmıştır (r= 0.681). Geliştirilen yöntem ile erime noktası sıcaklığı ($T _m$) analizine göre YMDD motifi mutasyonu araştırılmış ve $T _m$ değeri YMDD için 59.86°C, YVDD için 56.34°C ve YIDD için 55.10°C olarak belirlenmiştir. Homojen viral popülasyon içeren örneklerde, geliştirilen yöntemin sonuçları dizi analizi ve LiPA ile benzer bulunmuş; karışık viral popülasyon içeren serum örneklerinin analizinde ise geliştirilen yöntemin baskın olan viral tipi belirlediği tespit edilmiştir. Sonuç olarak, çalışmamızda geliştirilen bu testin hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir bir biçimde HBV-DNA düzeyi tayini ve YMDD motifi analizini, aynı çalışmada eş zamanlı olarak iki saat süre içinde gerçekleştirebildiği belirlenmiş; bu yöntemin, lamivudin tedavisi almakta olan kronik hepatit B enfeksiyonlu hastaların takibinde kullanılabilecek uygun bir yöntem olduğu düşünülmüştür.

Abstract

Monitoring therapy in chronic hepatitis B patients receiving lamivudine therapy, is done by two different assays; determination of viral load and genotypic resistance. These methods are labor intensive and time consuming. It was aimed to develop an assay to quantitate hepatitis B virus (HBV) DNA in serum and detect YMDD (thyrosine, methionine, aspartate, aspartate) motif mutations in the same run. The assay was based on real-time polymerase chain reaction (Rt-PCR) with YMDD-specific hybridization probes. Determination of YMDD motif was done by melting temperature analysis. External standard curve was used for quantifying viral DNA, which was generated by standard sera (VQC S2220) including HBV-DNA between concentrations of 1000 to 3 million copies/ml. The assay was compared with commercial quantitative kit (Artus HBV RG PCR; Qiagen, Germany), commercial line prob assay (INNO-LiPA HBV DR v1.0; Innogenetics, Belgium) and direct DNA sequencing method. Thirty-eight serum samples obtained from 20 chronic hepatitis B patients (7 female, 13 male; age range: 27-70 years) treated with only lamivudine and were negative for HIV and HCV antigen and antibodies were tested in the study. The analytical sensitivity of the assay was found as 200 copies/ml, with a dynamic range of 1 x $10^ 3$ to 3 x $10^ 7$ copies/ml. PCR efficiency of the in-house assay was found to be 1.98. Comparison of log10 HBV-DNA concentrations determined by the in-house and commercial quantitative kits showed a significant correlation (r= 0.681). Melting temperature ($T _m$) analysis was used for the YMDD motif determination and found to be 59.86°C for YMDD, 56.34°C for YVDD and 55.10°C for YIDD. The results of the in-house assay, DNA sequencing and LiPA were concordant in samples with homogeneous virus population, and in-house assay could also detect the major type of YMDD motif in mixed viral populations The Rt-PCR method which was developed in this study is a rapid, accurate and reproducible method for quantifying HBV-DNA and detecting the predominant YMDD motif in the same run in two hours duration. It was concluded that this method may be a convenient tool for monitoring HBV-infected patients receiving lamivudine treatment.