Dergiler / Mikrobiyoloji Bülteni / 2019 / Cilt: 53 - Sayı: 2
Leishmania tropica’nın Yeşil Floresan Protein (gfp) Geni ile Transfeksiyonu ve İn Vitro İlaç Etkisinin AraştırılmasıLeishmania tropica’nın Yeşil Floresan Protein (gfp) Geni ile Transfeksiyonu ve İn Vitro İlaç Etkisinin Araştırılması
- Sayfa
- 213–223
- DOI
- —
Özet
Kutanöz leyşmanyazis (KL) vektör kum sinekleri (Phlebotomus, Lutzomyia) tarafından bulaştırılan, deride uzun süre geçmeyen yaralar ile karakterize, etkeni Leishmania türleri olan bir protozoon parazit hastalığıdır. Türkiye’de Doğu ve Güneydoğu Anadolu Bölgelerinde yaygın görülen enfeksiyon etkeninin sıklıkla Leishmania tropica olduğu bilinmektedir. Ülkemizde göçler, artan seyahatler, sosyoekonomik düzeyin düşüklüğü ve ekolojik değişikliklerle birlikte olgu sayıları da gün geçtikçe artmaktadır. Tedavide sıklıkla beş değerli antimon bileşikleri intralezyoner olarak kullanılmakta ve son yıllarda dirençli olguların arttığı bildirilmektedir. Mevcut ilaçların yan etkileri, direnç gelişimi, toksik reaksiyonlar gibi nedenlerle yeni tedavi yöntemleri ve anti-leyşmanyal etkinliği olan yeni ilaçlar araştırılmaktadır. Bu araştırmalar öncelikle in vitro daha sonra in vivo deneysel modeller üzerinde yapılmaktadır. Raportör gen teknolojisinin son yıllarda mikroorganizmalarda biyolojik olayları irdelemek, ilaçların etkinlik ve direnç araştırmaları olmak üzere değişik amaçlarla kullanıldıkları bilinmektedir. Yeşil floresan proteinin (gfp) önemli kullanım alanları, farklı genlerin içerisine eklenerek bu genlerin farklı organizmalardaki ekspresyonlarının miktarının tayininde ve canlı hücreler içerisinde işaretleyici olarak kullanılabilmesidir. Bu proteini kodlayan gfp geni günümüzde oldukça sık kullanılmaktadır. Gen tabanlı analizlerin izlem kolaylığı, düşük maliyet ve gelişmiş biyogüvenlik dahil olmak üzere çeşitli avantajlarının olduğu belirtilmektedir. Bu çalışmada, L.tropica’nın “enhanced gfp (egfp)” ile transfeksiyonu ve konvansiyonel yöntemlere kıyasla bir ilaç tarama modeli olarak gfp-transfektanların in vitro olarak yararlılığını göstermek amaçlanmıştır. L.tropica promastigotları, elektroporasyon yöntemiyle p6.5/egfp ile transfekte edilmiş ve tunikamisin direnci ile seçilmiştir. Elde edilen gfp transfekte L.tropica promastigotları ile in vitro meglumin animoniat etkisi floresan mikroskopisi, florometre ve XTT (2,3-bis-(2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil)-2H-tetrazolyum-5-karboksianilid) testi ile farklı yöntemler kullanılarak değerlendirilmiştir. Potansiyel anti-leyşmanyal etkinin değerlendirilmesi için Leishmania izolatının gfp ile transfekte edilerek floresan mikroskopi ve florometri kullanılmasının geleneksel yöntemlere göre daha hızlı ve hassas olduğu sonucuna varılmıştır. Sonuç olarak, gfp-transfekte Leishmania türlerinin kullanımı in vitro ve in vivo anti-leyşmanyal ilaç araştırmaları ve aşı geliştirilmesi gibi hücresel düzeyde konak-parazit etkileşiminin biyolojisini anlamaya yardımcı olacaktır. Bu çalışma ile ülkemizde izole edilen L.tropica izolatları için daha sonra yapılacak araştırmalarda kullanılabilecek gfp transfekte modeli oluşturulmuştur.
Abstract
Cutaneous leishmaniasis (CL) is a parasitic disease transmitted by vector sand flies Phlebotomus and Lutzomyia. This disease is characterized by long time non-healing skin lesions, and caused by Leishmania species. CL is the most common infection in Eastern and Southeastern Anatolia in Turkey and L.tropica is known as the main agent of the disease. Number of cases is increasing in our country in time because of malnutrition, migration, travel, low socioeconomic level and ecological changes. For the treatment, the pentavalent antimonials are often used as intralesionally for many years, and it was reported that resistant cases have increased in recent years. New treatment methods and anti-Leishmanial activity of new agents have been investigated because of side effects, resistance development and toxic reactions of the present drugs. These studies are first carried out in vitro and afterwards with in vivo experimental animal models. Reporter gene technology has been used to investigate a variety of purposes like biological events in microorganisms and the efficacy and resistance of drugs in recent years. The major areas that green fluorescent protein (gfp) used are that they can be incorporated into different genes to determine the amount of expression of these genes in different organisms and can be used as markers in living cells. Especially gfp gene, which encodes the green fluorescent protein, is widely used nowadays. Gene-based assays have several advantages like being easy to follow-up, inexpensive and have improved biosecurity. The aim of the present study was to perform the transfection of L.tropica with “enhanced gfp (egfp)” and in vitro usefulness of gfp-transfectants as a drug screening model in comparison to the conventional methods. Promastigotes of L.tropica were transfected with p6.5/egfp by electroporation and selected for tunicamycin-resistance as previously described. L.tropica promastigotes transfected with gfp and in vitro effect of meglumine animoniate was assessed using different methods such as fluorescence microscopy, fluorometer and XTT (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide) assay. The use of gfp-transfected Leishmania strains was found more rapid and more sensitive by fluorescent microscopy and fluorometry than conventional assays for the evaluation of potential anti-leishmanial agents. Consequently, stable gfp-transfected Leishmania species will be used in vitro and in vivo for screening of anti-leishmanial drugs and vaccine development as well as for understanding the biology of the host-parasite interactions at the cellular level. As a result ot this study, gfp transfected model using a Turkish L.tropica isolate was established to be used in further studies.