Candida türlerinin biyofilm oluşturan ve planktonik formlarının antifungal ajanlara karşı in vitro duyarlılıklarının araştırılmasında iki farklı yöntemin karşılaştırılması

Comparison of two different methods for the investigation of in vitro susceptibilities of planktonic and biofilm forming candida species to antifungal agents

Özet

Antifungal ajanların Candida türlerine karşı, minimum inhibitör konsantrasyonu (MİK)’nu belirlemek için kullanılan mikrodilüsyon yöntemi, bu mikroorganizmaların hem biyofilm hem de planktonik formları için halen laboratuvarlarda kullanılan tek yöntemdir. Bununla birlikte birçok araştırmada, aynı mikroorganizmanın biyofilm ve planktonik formlarının in vitro duyarlılıklarında farklılık olduğu bildirilmiştir. Bu çalışmada, Candida suşlarının biyofilm oluşturan ve planktonik formlarının antifungal ilaçlara karşı duyarlılıklarının saptanması, elde edilen verilerin karşılaştırılması ve biyofilmdeki mayaların duyarlılığının saptanmasında kullanılan iki farklı yöntemin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmada, Candida albicans ATCC 10231, Candida krusei ATCC 6258 ve Candida parapsilosis ATCC 90028 standart suşları ile birer adet olmak üzere C.albicans, C.parapsilosis ve Candida tropicalis klinik izolatları kullanılmıştır. Planktonik formların duyarlılıklarının saptanmasında mikrodilüsyon yöntemi, CLSI M27-A3 standartlarına göre uygulanmış ve flukonazol, itrakonazol, flusitozin, amfoterisin B ve nistatin için MİK değerleri belirlenmiştir. Çalışmaya alınan suşların biyofilm formlarının duyarlılıkları ise aynı antifungal ilaçlara karşı Calgary biyofilm yöntemi (CBY) ve BioTimer yöntemi (BTY) ile araştırılmış ve minimum biyofilm eradikasyon konsant- rasyonu (MBEK) ve minimum biyofilm inhibisyon konsantrasyonu (MBİK) değerleri saptanmıştır. Çalışmamızda, MİK ile CBY-MBEK değerleri arasında, CBY-MBEK ile BTY-MBEK değerleri arasında ve CBYMBEK ile BTY-MBİK değerleri arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p 0.05). Bu bulgular, biyofilm oluşturan Candida suşlarının da in vitro duyarlılıklarının saptanması gerektiğini desteklerken, ilaçların etki mekanizmalarına ve mikroorganizmaların ilk inokülum konsantrasyonlarına bağlı olarak elde edilecek olan MBEK ve MBİK değerlerinin her zaman MİK değerlerinden daha yüksek olmayabileceğini de göstermektedir.

Abstract

Microdilution method that determines the minimum inhibitory concentrations (MIC) of antifungal agents against Candida spp. is still the only method used in laboratories for both biofilm and planktonic forms. However, it was determined in several studies that there were susceptibility differences between the biofilm and planktonic forms of the same microorganism. The aims of this study were the determination of in vitro susceptibilities of planktonic and biofilm forms of Candida strains against antifungal agents, the comparison of the data obtained from planktonic and biofilm forms and the evaluation of two different methods used for the detection of susceptibilities of biofilm forms. Candida albicans ATCC 10231, Candida parapsilosis ATCC 90028 and Candida krusei ATCC 6258 were used as reference strains together with clinical isolates of one of each C.albicans, C.parapsilosis and Candida tropicalis. Microdilution method was used to determine the susceptibilities of planktonic forms of the strains according to CLSI M27-A3 standards, and MIC values of fluconazole, itraconazole, flucytosine, amphotericin B and nystatin were determined. For the detection of antifungal susceptibilities of Candida spp. biofilm forms, Calgary biofilm method (CBM) and BioTimer assay (BTA) were used, and minimum biofilm eradication concentration (MBEC) and minimum biofilm inhibition concentration (MBIC) values of the same antifungals were determined. The difference between MIC and CBM-MBEC, CBM-MBEC and BTA-MBEC, CBM-MBEC and BTAMBIC values were found statistically significant (p< 0.05). In general CBM-MBEC values were found to be higher than MIC values. However, MBEC values were not always very reliable since the exact number of the microorganisms in biofilm can not be determined. BTA-MBIC values were also generally lower than the MBEC values and higher than the MIC values. Statistically significant difference between two methods was determined only for the MBEC values of flucytosine (p= 0.002) and itraconazole (p= 0.025). For flucytosine (p= 0.001) and itraconazole (p= 0.001), there was also a significant difference between CBM-MBEC and BTA-MBIC values, however, the difference was not significant (p> 0.05) for the other antifungal agents. These findings supported that antifungal susceptibilities of biofilm forming Candida strains should also be investigated. However, MBEC and MBIC of the antifungal agents should not always be expected to be higher than the MIC values since the mechanism of action of the specific antifungal agents and the first inoculum concentration of the microorganisms might differ.