Sefoksitine dirençli escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae klinik izolatlarında plazmid aracılı AmpC beta-laktamaz tespiti

Detection of plasmid-mediated AmpC beta-lactamase in clinical isolates of cefoxitin-resistant Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae

Özet

Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz (GSBL) veya AmpC beta-laktamaz sentezleyen izolatlar laboratuvarda geniş spektrumlu sefalosporinlere karşı yanlışlıkla duyarlı olarak rapor edilebilmektedir. Sınıf A (GSBL) ve sınıf B (MBL) beta-laktamazların tespiti için tarama ve doğrulama yöntemleri yayınlandığı halde AmpC beta-laktamazların tespiti için bugüne kadar bir yöntem yayınlanmamıştır. Bu çalışmada, AmpC beta-laktamazları tespit etmek için uygulanan üç farklı fenotipik yöntemin [boronik asit (BA)-klavulanik asit (CA) ile inhibisyon testi, TRIS-EDTA’lı AmpC disk testi ve modifiye üç boyutlu test (M3BT)] performanslarının değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Haziran-Eylül 2009 tarihleri arasında sefoksitine dirençli 50 (42’si Escherichia coli, sekizi Klebsiella pneumoniae) klinik izolat toplanmıştır. Plazmid aracılı AmpC laktamazlar DHA, EBC, CIT, FOX ve MOX primerlerinin kullanıldığı multipleks polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile genotipik olarak doğrulanmıştır. Sefoksitine dirençli 50 izolatın 25 (%50)’i BA-CA testiyle AmpC pozitif olarak bulunmuştur. BA-CA ile AmpC pozitif bulunan 25 izolatın 22 (%88)’si multipleks PCR ile pozitif sonuç vermiştir. PCR ile AmpC pozitif bulunan izolatların hepsi CIT (CMY-2 ile CMY-7 arası, LAT-1 ile LAT-7 arası ve BIL-1 AmpC beta-laktamazların bulunduğu grup) ailesine ait AmpC beta-laktamazlardır. İzolatların birinde hem CIT hem de EBC tipi AmpC enzim, birinde de CIT + MOX + GSBL birlikte görülmüştür. Bu çalışmada DHA ve FOX tipi AmpC ailesine ait beta-laktamaz tespit edilememiştir. AmpC enzim sentezleyen 21 izolatın (AmpC disk testi ve M3BT’nin uygulanamadığı PCR pozitif bir izolat hariç) 11 (%52.3)’inde AmpC disk testi ve M3BT pozitif olarak bulunmuştur. CA ile inhibisyon testine BA ilave edildikten sonra AmpC enziminin BA ile inhibisyonuna bağlı olarak GSBL sayısı 13’ten 14 (%63.6)’e çıkmıştır. Ayrıca 3-aminofenilboronik asit ile negatif sonuç veren izolatlar, benzenboronik asit ile tekrar test edilmiş; üç izolatta daha benzenboronik asit ile pozitif sonuç elde edilmiştir. Bu sonuca göre, BA inhibisyon testinde kullanılan benzenboronik asit veya 3-aminofenilboronik asit ile ilgili daha fazla araştırmalara ihtiyaç vardır. Sonuç olarak, AmpC beta-laktamazın fenotipik olarak tespiti için BA-CA testi, uygulanması basit ve yorumu kolay bir testtir. Kısaca, GSBL’nin AmpC beta-laktamazları maskeleyerek yanlış sonuç vermesini önlemek için BA inhibisyon testine CA eklenmelidir. AmpC beta-laktamazların GSBL’yi maskeleyerek yanlış sonuç vermesini önlemek için de CA inhibisyon testine BA eklenmelidir.

Abstract

Extended spectrum beta-lactamases (ESBL) or AmpC beta-lactamases may be associated with false cephalosporin susceptibility results. Although there are well-established methods for screening and confirmation of class A (ESBL) and class B metallobeta-lactamases (MBL), there is no current guideline for the detection of AmpC beta-lactamases. The aim of this study was to evaluate the performances of three different phenotypic tests [boronic acid (BA) - klavulanic acid (CA) inhibition test, AmpC disk test (TRISEDTA impregnanted), modified 3-dimensional test (M3DT)] for the detection of AmpC beta-lactamases. A total of 50 (42 were Escherichia coli and eight were Klebsiella pneumoniae) cefoxitin-insusceptible strains were collected during June-September 2009. Multiplex PCR was used as the genotypic confirmation test by using DHA, CIT, MOX, FOX and EBC primers. Twenty-five (50%) of 50 cefoxitin-insusceptible strains yielded positive result by BA-CA test. Twenty two (88%) of 25 BA-CA positive strains yielded positive result by multiplex PCR and all of them belonged to CIT family (CMY-2 to CMY-7, LAT-1 to LAT-4 and BIL-1 type) of AmpC beta-lactamases. One strain harboured both CIT and EBC family of AmpC beta- lactamases, one strain harboured CIT + MOX + ESBL. DHA and FOX family of AmpC beta-lactamases were not detected in this study. Both AmpC disk test and M3DT yielded positive test with 11 (52.3%) of 21 AmpC enzyme producing strains (except for one of the PCR positive strain which couldn’t be screened by M3DT and AmpC disk test). When BA was added to CA inhibition test, the number of positive isolates of ESBL increased from 13 to 14 (63.6%) due to inhibition of AmpC with BA. Hovewer, the strains which yielded negative results by 3-aminophenylboronic acid (3-APB) were tested again by benzeneboronic acid. Three strains were also found to be positive with benzeneboronic acid. The results of this study indicated that BA test with benzene boronic acid or 3-APB warranted further study. In conclusion, for the phenotypic detection of AmpC beta-lactamases, BA-CA test is simple to perform and easy to interpret. Briefly, in order to prevent the masking effect of ESBL, CA must be added to the BA inhibition test. Also in order to prevent the masking effect of AmpC beta-lactamases on ESBL detection, BA must be added to the CA inhibition test.