Dergiler / Mikrobiyoloji Bülteni / 2015 / Cilt: 49 - Sayı: 1
Dışkı örneklerinde blastocystis spp. varlığının mikroskobik, kültür ve moleküler yöntemlerle araştırılması*
- Sayfa
- 85–97
- DOI
- —
Özet
Blastocystis türleri, insan ve hayvanlarda yaygın olarak görülen enterik protozoonlardır. Günümüzde 17 alt tipi saptanmış olup bunlardan dokuzu insandan izole edilmiştir. Blastocystis türlerinin pleomorfik yapısı, genetik çeşitliliği ve standardize edilmiş tanımlama yöntemlerinin bulunmaması, verilerin yorum- lanmasını zorlaştırmaktadır. Rutin tanıda çoğunlukla nativ-lugol ve trikrom boyama gibi mikroskobik yön- temler kullanılmakta olup, kültür ve moleküler yöntemler daha ziyade araştırma amacıyla tercih edilmek- tedir. Bu çalışmada, gastrointestinal şikayetleri olan hastaların dışkı örneklerinde Blastocystis spp. varlığının mikroskobik ve kültür yöntemleri ile araştırılması ve izole edilen suşların polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile alt tip tayininin yapılması amaçlanmıştır. Çalışmaya, ishalli olan (n= 157) ve olmayan (n= 193) hasta- lara ait toplam 350 dışkı örneği dahil edilmiştir. Örneklerde Blastocystis spp. varlığı, nativ-lugol inceleme, trikrom boyama ve direkt floresan antikor (DFA) yöntemleri ile araştırılmış; kültür için %10 at serumu ve %0.05 asparajin içeren Ringers solüsyonu kullanılmıştır. Kültürler 37oCde 3-4 günlük inkübasyon son- rasında mikroskobik inceleme ile değerlendirilmiştir. Kültürden elde edilen Blastocystis spp. izolatlarının alt tip tayini STS (sequenced-tagged site) primerleri kullanılarak PCR ile yapılmıştır. Çalışmada, ishalli hastaların 26 (%16.6)sı ve ishalli olmayanların 40 (%21)ı olmak üzere toplam 66 (%19) dışkı örneğinin kültüründen Blastocystis sp. izolasyonu yapılmıştır. Örneklerin %12 (42/350)si nativ-lugol inceleme, %17si (58/350) trikrom boyama ve %19 (66/350)u DFA yöntemi ile pozitif sonuç vermiştir. Yapılan değerlendirmede, nativ-lugol yönteminin kültür yöntemi ile uyumu güçlü (κ= 0.752), trikrom boyama ve DFA yöntemlerinin kültür yöntemi ile uyumları ise çok güçlü (sırasıyla κ= 0.922 ve κ= 1.00) bulunmuştur. Kültür yöntemi referans olarak alındığında, nativ-lugol, trikrom boyama ve DFA yöntemlerinin duyarlılık ve özgüllükleri sırasıyla %65 ve %100, %88 ve %100, %100 ve %100 olarak hesaplanmıştır. Blastocystis spp. pozitif saptanan örneklerin 43 (%65)ünde PCR ile alt tip (ST) tayini yapılmış, 23 suş tiplendirileme- miştir. Buna göre en sık tespit edilen alt tip ST3 (12/43; %28) olmuş; bunu ST1 (6/43; %13.9), ST4 (5/43; %11.6) ve ST7 (5/43; %11.6), ST2 (3/43; %7) ve ST6 (1/43; %2.3) izlemiştir. Örneklerin hiçbirinde ST5 tespit edilmemiş; 11 (%25.6) örnekte alt tiplerin karışık olarak bulunduğu görülmüştür. İshalli olan ve olmayan olgu grupları arasında Blastocystis spp. pozitifliği ve alt tip dağılımı açısından istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmamıştır (p> 0.05). Ülkemizde yapılan diğer çalışmalarda olduğu gibi bu çalışmada da en sık ST3 tespit edilirken, ST6 ve ST7 ilk kez tanımlanmıştır. Sonuç olarak, kültür yönteminin zaman alıcı ve zahmetli olması, nativ-lugol yönteminin duyarlılığının düşük olması, PCR yönteminin ise maliyetinin yüksek ve standardize edilmemiş olması gibi nedenlerle, rutin tanı laboratuvarlarında Blastocystis spp. sap- tanmasında hızlı, pratik ve yüksek duyarlılığı olan DFA yönteminin kullanılabileceği görüşüne varılmıştır.
Abstract
Blastocystis species are enteric protozoa frequently detected in human and animals. Seventeen sub- types (STs) have now been identified, nine of them isolating from humans. The pleomorphic structure and genetic diversity of Blastocystis spp. and the absence of standardized diagnostic methods complicate the evaluation of current data. Microscopic methods such as native-lugol and trichrome staining are most frequently used methods in routine diagnosis, while culture and molecular methods are preferred for research purposes. The aims of this study were to investigate the presence of Blastocystis spp. in the stool samples of patients with gastrointestinal complaints by microscopic and culture methods, and to detect the subtypes of isolates by polymerase chain reaction (PCR). A total of 350 stool samples collected from patients with diarrhea (n= 157) and without diarrhea (n= 193) were included in the study. Presence of Blastocystis spp. in the samples were investigated by native-lugol examination, trichrome staining and direct fluorescent antibody (DFA) methods. Ringers solution containing 10% horse serum and 0.05% asparagine was used for cultivation. The cultures were evaluated after 3-4 days of incubation at 37 oC by microscopic examination. The subtypes of Blastocystis spp. strains isolated from the cultures have been identified by PCR using sequence-tagged site primers. A total of 66 (19%) stool samples, of them 26 (16.6%) were from diarrheal and 40 (21%) from non-diarrheal cases, yielded Blastocystis sp. growth in culture. Among the evaluated samples, 12% (42/350) were found positive with native-lugol examination, 17% (58/350) with trichrome staining, and 19% (66/350) with DFA method. The agreement of culture and native-lugol method was estimated as strong (κ= 0.752), while it was very strong between culture with trichrome staining and DFA methods (κ= 0.922 and κ= 1.00, respectively). When the culture was accepted as reference method, the sensitivity and specificity rates of native-lugol method were 65% and 100%, trichrome staining method were 88% and 100%, and DFA method were 100% and 100%, respec- tively. Forty-three (65%) of Blastocystis spp. positive samples were subtyped by PCR, while 23 isolates could not be subtyped. The most frequent detected subtype was ST3 (12/43; 28%), followed by ST1 (6/43; 13.9%), ST4 (5/43; 11.6%) and ST7 (5/43; 11.6%), ST2 (3/43; 7%) and ST6 (1/43; 2.3%). ST5 was not detected in this study and 11 (25.6%) samples have been identified to have mixed subtypes. The differences of Blastocystis spp. positivity rates and the distribution of the subtypes between the patients with or without diarrhea were not found statistically significant (p> 0.05). In our study, ST3 was the most frequently identified Blastocystis spp. subtype, similar to the previous national studies, however ST6 and ST7 have been identified for the first time. In conclusion, as the sensitivity of native-lugol examination is low, culture is time-consuming and laborious and PCR methods are costly and non-standardized, rapid, practical and high sensitive DFA is considered as the favourable method in the diagnosis of Blastocystis spp. in routine laboratories.