Flukonazole dirençli Candida albicans izolatlarında atım pompa ekspresyonlarının araştırılması

Investigation of the expression levels of efflux pumps in fluconazole-resistant Candida albicans isolates

Özet

Flukonazolün profilaksi ve sağaltımda yaygın ve tekrarlayan kullanımı Candida albicans suşlarında direnç gelişimine yol açmıştır. Çalışmamızda, flukonazole dirençli ve duyarlı C.albicans izolatlarında atım pompalarını kodlayan CDR1, CDR2 ve MDR1 genlerinin ekspresyonu araştırılarak flukonazol direncinde bu mekanizmanın rolünün belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya, flukonazole dirençli beş, flukonazole duyarlı altı ve kısmi inhibisyon etkisi gösteren duyarlı dört C.albicans suşu dahil edilmiştir. Suşların fluko- nazol ve diğer antifungaller için MİK değerleri mikrodilüsyon yöntemiyle belirlenmiştir. Dirençli suşların flukonazol duyarlılıkları ayrıca, siklosporin A içeren ve içermeyen maya özütlü pepton dekstroz agarda E-test ile de incelenmiştir. CDR1, CDR2 ve MDR1 genlerinin ekspresyon düzeyleri, gerçek zamanlı PCR yöntemi ile araştırılmıştır. Bu genlerin ekspresyonu ACT1 seviyeleri ile normalize edilmiş ve flukonazole duyarlı C.albicans ATCC 14053 kontrol suşu ile karşılaştırılmıştır. Tüm suşların amfoterisin B’ye duyarlı ve bir izolat hariç tümünün klotrimazole de duyarlı olduğu görülmüştür. Flukonazole dirençli beş suşun üçü ve kısmi inhibisyon etkisi gösteren dört suşun üçü 5-flusitozine dirençli, duyarlı suşların ise biri hariç tümü 5-flusitozine orta duyarlı olarak bulunmuştur. Flukonazole dirençli suşların, biri hariç tümünün itrakonazol ve ketokonazole dirençli, mikonazol için ise ≥ 64 μg/ml MİK değerlerine sahip oldukları belirlenmiştir. Flukonazole duyarlı tüm suşlar ketokonazole duyarlı, itrakonazole doza bağımlı duyarlı bulunmuştur. Flukonazole dirençli ve duyarlı suşların vorikonazole duyarlı olduğu belirlenmiştir. Kontrol suşu ile kar- şılaştırıldığında; flukonazole dirençli beş suşun ikisinin yüksek, üçünün orta düzeyde CDR1/2 ve birinin yüksek, üçünün ise düşük düzeylerde MDR1 gen ekspresyonu yaptığı tespit edilmiştir. Kısmi inhibisyon etkisi gösteren duyarlı suşlardan birinde görülen yüksek MDR1 ekspresyonu dışında, orta düzeylerde CDR1, CDR2 ve MDR1 fazla ekspresyonu gözlenirken, duyarlı izolatlar üç suş dışında atım pompalarını düşük düzeylerde eksprese etmiştir. CDR1 ve CDR2 ekspresyon düzeylerinin aynı suş için tüm izolatlarda paralel olduğu belirlenmiştir. Çalışmamıza alınan flukonazole dirençli C.albicans izolatlarında atım pompa genlerinin fazla ekspresyonunun dirençten sorumlu önemli bir mekanizma olduğu sonucuna varılmıştır.

Abstract

Widespread and repeated use of fluconazole in the prophylaxis and therapy resulted in resistance among Candida strains. Investigation of the expression of efflux pump encoding genes was aimed in fluconazole-resistant and -susceptible C.albicans isolates in order to determine the role of this mecha- nism in fluconazole resistance. Five fluconazole-resistant, six -susceptible and four trailing effect show- ing susceptible C.albicans isolates were included in the study. The MIC values of fluconazole and other antifungal agents were determined by the microdilution method. The fluconazole MIC values of the fluconazole-resistant strains were also studied by E-test performed on yeast extract peptone dextrose agar with and without cyclosporin A. The expression levels of CDR1, CDR2 and MDR1 transcripts were determined by real-time PCR method. The expression of these genes was normalized with their ACT1 levels and compared with the fluconazole-susceptible C.albicans ATCC 14053 strain. It was detected that all strains were susceptible to amphotericin B and all except one strain were also susceptible to clotrimazole. Three out of five fluconazole-resistant strains and three out of four trailing effect showing susceptible strains were resistant to 5-flucytosine, and all except one susceptible strains were found as intermediate to 5-flucytosine. All except one fluconazole-resistant strains were determined as resistant to itraconazole and ketoconazole, and had miconazole MIC values of ≥ 64 μg/ml. All fluconazole-suscep- tible isolates were detected to be susceptible to ketoconazole and dose dependent susceptible to itra- conazole. Fluconazole-resistant and -susceptible strains were determined as susceptible to voriconazole. Out of five fluconazole-resistant isolates, two strains overexpressed high levels and three strains overex- pressed mild levels of CDR1/2; one strain overexpressed high levels and three strains overexpressed low levels of MDR1 in comparison to C.albicans ATCC 14053 control strain. It was observed that CDR1, CDR2 and MDR1 gene expression levels were mild in strains showing trailing effect except one which highly expressed MDR1, while susceptible isolates except three expressed efflux pump genes at low levels. It was determined that the expression levels of CDR1 and CDR2 genes for the same strain were in parallel for all isolates. It can be concluded that overexpression of efflux pump genes is an important mechanism of resistance in fluconazole-resistant C.albicans isolates.