Dergiler / Mikrobiyoloji Bülteni / 2014 / Cilt: 48 - Sayı: 3
BACTEC MGITTM pozitif kültürlerden Mycobacterium türlerinin oligo-FISH ve PNA-FISH yöntemleriyle tanımlanması
- Sayfa
- 385–401
- DOI
- —
Özet
Mikobakterilerin hızlı ve doğru tanısı, günümüzde halen ciddi bir halk sağlığı sorunu olan tüberkülo- zun önlenmesi ve hastaların etkin tedavisi için önem taşımaktadır. Fluoresan in situ hibridizasyon (FISH) yöntemi, rRNA’yı hedef alan problar kullanılarak direkt klinik örnekler ve kültürlerden, karışık ortamdaki mikroorganizmaların birkaç saat içinde kesin ve doğru tanımlanmasına olanak sağlamaktadır. Bu çalış- mada, BACTEC MGITTM (Mycobacteria Growth Indicator Tube) pozitif kültürlerden mikobakteri türle- rinin tanımlanması için iki farklı FISH (Oligo-FISH ve PNA-FISH) yönteminin konvansiyonel yöntemlerle karşılaştırılarak rutin laboratuvar kullanımındaki tanısal performansının değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya, 60 MGIT (BD, ABD) pozitif ve 52 MGIT negatif kültür ile 10 farklı referans suş dahil edilmiş- tir. Oligo-FISH yönteminde, 16S rRNA’yı hedef alan oligonükleotid problar (Myc657: Mycobacterium subdivision, Eub338: Pozitif kontrol, NonEub: Negatif kontrol); PNA-FISH yönteminde ise 16S rRNA’yı hedef alan peptid nükleik asit problar (MTC: Mycobacterium tuberculosis kompleks, NTM: Tüberküloz dışı mikobakteri, BacUni: Pozitif kontrol) kullanılmıştır. Konvansiyonel yöntemler olarak, MGIT 960 kültür sis- teminin yanı sıra Ehrlich-Ziehl-Neelsen boyama (ARB) ve Löwenstein-Jensen (LJ) besiyerinde kültür yön- temleri uygulanmıştır. Çalışmaya alınan MGIT pozitif 60 (44 balgam, 4 doku, 4 idrar, 3 bronkoalveoler lavaj, 3 BOS, 1 apse, 1 periton sıvısı) kültürden 29 (%48.3)’u ARB ile, 44 (%73.3)’ü LJ kültür yöntemi ile olmak üzere toplam 59’u pozitif sonuç vermiş; bunların 58 (%96.6)’i MTC, 1 (%1.7)’i ise NTM olarak tiplendirilmiştir. Oligo-FISH ile izolatların %95 (57/60)’i Mycobacterium spp. olarak saptanırken, 3 (%5)‘ü negatif bulunmuştur. PNA-FISH ile 54 (%91.5) izolat mikobakteri olarak saptanmış ve bu izolatlardan 53 (%90)’ü MTC, 1 (%1.7)’i NTM olarak tiplendirilmiştir. Oligo-FISH ile pozitif, PNA-FISH ile negatif sonuç veren beş izolatın tanımlanmasında ise, PNA-FISH yönteminde yapılan minör modifikasyon ile pozitif sonuç elde edilmiştir. Oligo- ve PNA-FISH yöntemlerinin, MGIT pozitif kültürlerden mikobakterileri tanımlama süresi konvansiyonel yöntemlere göre daha kısa olup (2-2.5 saat), her iki FISH yönteminin konvansiyonel yöntemlere göre, PNA-FISH yönteminin de Oligo-FISH’e göre daha pratik olduğu sap- tanmıştır. Oligo-FISH yönteminin duyarlılık, özgüllük, pozitif ve negatif prediktif değeri sırasıyla, %96.6, %100, %100 ve %96.4 olarak belirlenmiş; bu değerler PNA-FISH için sırasıyla, %91.5, %100, %100 ve %91.4 olarak bulunmuştur (p< 0.0001). Yöntemlerin uyumluluğu kappa istatistiksel analizi kullanılarak belirlenmiş; her iki FISH yöntemi arasında ve her ikisi ile konvansiyonel yöntemler arasında mükemmel uyumluluk saptanmıştır (κ: 0.964, 0.929, 0.964; p= 0.001).
Abstract
Rapid and accurate diagnosis of mycobacteria is very important in the prevention and effective treatment of tuberculosis which is still a serious public health problem. Fluorescence in situ hybridiza- tion (FISH) method using rRNA targeted probes allows for precise and accurate identification of mixed microorganisms from cultures and directly from clinical samples within a few hours without the need for culture methods. In this study it was aimed to compare the diagnostic performance of two different FISH methods (Oligo-FISH and PNA-FISH) with the conventional culture methods for the identification of Mycobacterium spp. grown in BACTEC MGITTM (Mycobacteria Growth Indicator Tube) system. A total of 60 MGIT (BD, USA) positive, 52 MGIT negative samples and 10 different reference strains were included in the study. 16S rRNA targeted oligonucleotide probes (Myc657: Mycobacterium subdivision, Eub338: Positive control, NonEub: Negative control) were used for oligo-FISH, and 16S rRNA targeted peptide nucleotide probes (MTC: Mycobacterium tuberculosis complex, NTM: Non-tuberculosis Mycobacterium, BacUni: Positive control) for PNA-FISH. Ehrlich-Ziehl-Neelsen staining (ARB) and Löwenstein-Jensen (LJ) culture methods were performed as conventional methods as well as MGIT 960 culture system. Of MGIT positive 60 samples (44 sputum, 4 tissue, 4 urine, 3 bronchoalveolar lavage, 3 CSF, 1 abscess, 1 peritoneal fluid), 29 (48.3%) were found positive for ARB and 44 (73.3%) with LJ culture methods giving a total of 59 positive results. Fifty-eight (96.6%) of those isolates were identified as MTC, and one (1.7%) as NTM by conventional methods. By using Oligo-FISH, 95% (57/60) of the isolates were identified as Mycobacterium spp., while three samples (5%) yielded negative result. By using PNA-FISH, 54 (91.5%) isolates were identified as mycobacteria, of them 53 (90%) were typed as MTC and 1 (1.7%) as NTM. Five isolates that were found positive with Oligo-FISH, but negative with PNA-FISH, yielded positive result with PNA-FISH method performed with minor modifications. It was determined that both FISH methods are more rapid (approximately 2-2.5 hours) and practical than the conventional culture methods and also PNA-FISH was more practical than Oligo-FISH. The sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of the probes used for Oligo-FISH, were 96.6%, 100%, 100% and 96.4%, respectively. Those values for the probes used for PNA-FISH, were 91.5%, 100%, 100% and 91.4%, respectively (p< 0.0001).