Dergiler / Mikrobiyoloji Bülteni / 2017 / Cilt: 51 - Sayı: 2
Caco-2 İnsan Kolon Epidermal Adenokarsinom ve THP-1 İnsan Lösemi Monosit Hücre Dizilerinin Çeşitli Koşullarda Toxoplasma gondii'ye Karşı Sitokin Yanıtlarının ve İnsan Beta-defensin-3 Ekspresyon Değişikliklerinin Araştırılması
- Sayfa
- 156–164
- DOI
- —
Özet
Mononükleer fagositer hücreler ve epitel hücreleri, doğal bağışıklığın başlatılması ve düzenlenmesinde etki gösteren hücrelerdir. Hem mekanik olarak hem de sitokin salınımı ile etkileşerek mukozal bağışık yanıtta etkin rol oynamaktadırlar. Bunun yanında defensinler, çeşitli hücrelerden salınarak ilk hat bağışık yanıtta etkili olduğu düşünülen mikrobisidal peptitlerdir. Toxoplasma gondii'ye karşı oluşan hücresel bağışıklıkta IL-12 ve IL-10, sırasıyla pro-inflamatuvar ve anti-inflamatuvar özellikleri ile konakta immünopatoloji oluşmadan enfeksiyonun kontrolünü sağlayan iki sitokindir. Bu çalışmada, Caco-2 (insan kolon epidermal adenokarsinom hücresi) ve THP-1 (insan lösemi monosit hücresi) hücre dizilerinin birlikte veya tek başlarına, canlı T.gondii takizoitleri ile doğrudan veya araya teması engelleyecek bir filtre konarak karşılaştırılması sonucunda, hücrelerden IL-12 ve IL-10 salınımında ve insan beta-defensin-3 (hBD-3) ekspresyonunda meydana gelebilecek değişikliklerin in vitro koşullarda gözlenmesi amaçlanmıştır. Deney kuyucuklarındaki hücrelere RH suşu takizoitlerinin eklenmesinden 24 saat sonra toplanan üst sıvılarda insan IL-12 ve IL-10 sitokinlerinin saptanması için ticari ELISA kitleri (Invitrogen) üreticinin talimatları doğrultusunda kullanılmıştır. Deneylerden dört ve 24 saat sonra kuyucuklardan toplanan hücrelerde gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile kantitatif olarak hBD-3 ekspresyonu belirlenmiştir. Bu amaçla, öncelikle ticari kit (High pure RNA isolation kit, Roche Diagnostics, Almanya) kullanılarak RNA ekstraksiyonu gerçekleştirilmiş, daha sonra yine ticari kit (Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit, Roche Diagnostics, Almanya) ile komplementer DNA (c-DNA) elde edilmiştir. IL-12 tüm deney kuyucuklarında IL-10'dan daha fazla bulunmuştur. IL-12 salınımının, Caco-2 ve THP-1 hücre ko-kültürlerinin takizoitler ile enfekte edildiği kuyucuklarda, hücrelerin tek başlarına enfekte edildiği kuyucuklardan daha fazla olduğu gözlenmiştir. T.gondii'nin hücreler ile doğrudan temas ettiği veya temas etmeden inkübe edildiği kuyucuklar arasında fark olmadığı saptanmıştır. HBD-3 ekspresyonunun ölçüldüğü deneylerde ise, Caco-2 ve THP-1 hücreleri ko-kültür ortamında T.gondii ile enfekte edildiklerinde birbirleriyle etkileşmiş ve ayrı ayrı enfekte edildiklerinden daha fazla hBD-3 ekspresyonu göstermiştir. Bu çalışma, T.gondii'nin çeşitli antijenleri ile uyarılmış mononükleer hücre ve epitel hücresinin etkileşim içinde olduklarında, doğal bağışıklıkta rol oynayan IL-12 salınımının ve hBD-3 ekspresyonun daha fazla olduğunu ortaya koymuştur.
Abstract
Mononuclear phogocytic cells and epithelial cells are effective during the initiation and regulation of the innate immune response. They have an active role in mucosal immune response both mechanically and by interaction with other cells with cytokine release. Defensins are microbicidal peptides that are expressed in various cells and are thought to be effective in the first line defense against pathogens. IL-12 and IL-10, showing proinflamatory and antiinflamatory activities, respectively, are actors of the cellular immunity and limit the infection of the host without causing immunopathology. The aim of this study was to observe the differences in the release of IL-12 and IL-10 and the expression of human beta-defensin-3 (hBD-3) inCaco-2 (human colon epidermal adenocarcinoma cell) and THP-1 (human leukemia monocytic cell) cell lines cultured alone or in co-culture, by the stimulation of Toxoplasma gondii tachyzoites either in direct contact with the cells or separated by an insert filter from the cells. Twentyfour hours after the addition of RH strain tachyzoites to the cells, the supernatants were collected from the experiment wells, and commercial ELISA kits (Invitrogen) were used according to the manufacturers instructions to measure IL-12 and IL-10 levels. HBD-3 expression of cells collected from the experiment wells afterfour and 24 hourswere analyzed by using real time PCR. For this procedure, complementary c-DNA was obtained (Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit, Roche Diagnostics, Germany)after the extraction of RNA with a commercial kit (High pure RNA isolation kit, Roche Diagnostics, Germany). IL-12 was higher than IL-10 in all experiment wells. IL-12 was induced more in the co-culture wells where Caco-2 and THP-1 cells were challenged together, than the wells in which the cells infected with T.gondii tachyzoites alone. No differences in respect to cytokine response were observed between the cells with which tachyzoites were in contact and the cells which were separated from the parasites with an insert. In hBD-3 experiments, Caco-2 and THP-1 cells interacted in co-culture wells when infected with tachyzoites and displayed a higher level of hBD-3 expression than the condition when they were infected alone. This study showed that, IL-12 release and hBD-3 expression, which play a role in innate immunity, are greater when various antigens of T.gondii interacted with stimulated mononuclear cell and epithelial cells.