Staphylococcus aureus İzolatlarında Biyofilm Üretiminin Genotipik ve Fenotipik Karakterlerinin Karşılaştırılması

Comparison of Genotypic and Phenotypic Characteristics in Biofilm Production of Staphylococcus aureus Isolates

Özet

Staphylococcus aureus hastalık etkeni olan önemli bir mikroorganizmadır. S.aureus izolatlarının patojenitesi; aderans özellikleri, çeşitli toksinler, enzimler, yapısal ve ekstraselüler faktörler gibi özelliklere bağlıdır. Bakterinin slime ve biyofilm üretimi de patojenite faktörleri arasında yer almaktadır. Hastalarda kronik enfeksiyonların devamlılığı ile ilgili olduğu düşünülen biyofilm üretimi, son yıllarda araştırmacıların ilgisini çeken bir konudur. Biyofilm, serbest yaşayan organizmaların uygun bir yüzeye tutunup kümeleşerek ürettikleri matriks ile oluşturdukları bir tabakadır. Bu tabaka, S.aureus’ta antibiyotik direnci ve konak hücrelerinin fagositozuna engel olması sebebiyle, S.aureus’a bağlı enfeksiyonların tedavisini zorlaştırmaktadır. S.aureus türünde biyofilm tabakası oluşumundan icaADBC lokusu ve bazı proteinler sorumlu tutulmaktadır. Bu çalışmada, S.aureus izolatlarında biyofilm üretiminin gösterilmesinde kullanılan fenotipik yöntemler ile biyofilm üretiminden sorumlu olan icaA, icaD ve bap genleri arasındaki ilişkinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmada, Mikrobiyoloji Laboratuvarına gelen çeşitli klinik örneklerden elde edilen 175 S.aureus izolatı kullanılmıştır. Çalışmada biyofilm üretiminin fenotipik tespitinde Kongo Kırmızısı Agar (KKA) besiyeri ve mikroplak yöntemi kullanılmıştır. Çalışmada pozitif kontrol olarak Staphylococcus epidermidis ATCC 35984, negatif kontrol olarak S.epidermidis ATCC 12228 suşları kullanılmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile biyofilm üretimi KKA ve mikroplak yönteminin en az birisinde pozitif olarak saptanan 152 S.aureus izolatı değerlendirilmiştir. İzolatlarda biyofilm oluşumunda görev yaptığı düşünülen icaA, icaD ve bap genleri araştırılmıştır. Çalışmada ayrıca, bu genlerin bir ürünü olan polisakkarid interselüler adezin (PIA) üretimi araştırılmıştır. PIA varlığının tespitinde bileşimindeki poli-N-asetil-beta-1-6-glukozamin (PNAG) yapısını gösterebilmek için kemilüminesans dot-blot yöntemi kullanılmıştır. KKA besiyerinde koloni morfolojisine dayanan fenotipik değerlendirmeler sonrasında 175 örneğin 101 (%57.7)’inde biyofilm üretimi negatif olarak bulunurken, 74 (%42.3)’ünde biyofilm üretimi pozitif olarak bulunmuştur. Mikroplakta kantitatif değerlendirme sonucunda örneklerin 34 (%19.4)’ünde biyofilm üretimi negatif, 112 (%64.0)’sinde orta derece ve 29 (%16.6)’unda güçlü olarak belirlenmiştir. Mikroplak yöntemi ve KKA biyofilm üretimini tespit etmek açısından karşılaştırıldığında birbiriyle uyumsuz bulunmuştur (p< 0.001). Biyofilm oluşumundan sorumlu genlerin varlığının araştırılmasında kullanılan 152 klinik izolatın 136 (%89.5)’sında ve pozitif kontrol olarak kullanılan S.epidermidis ATCC 35984 suşunda icaA ve icaD saptanmıştır. Çalışma kapsamındaki 152 klinik izolatın 16 (%10.5)’sında ve negatif kontrol olarak kullanılan S.epidermidis ATCC 12228 suşunda icaA ve icaD genleri saptanmamıştır. KKA besiyerinde gözlenen biyofilm üretimi ile icaA ve icaD genleri arasında zayıf-orta derecede ilişki saptanmıştır (r= 0.257, p= 0.001). Mikroplak yönteminde saptanan biyofilm üretimi ile icaA ve icaD genleri arasında iyi derecede ilişki bulunmuştur (r= 0.559, p< 0.001). Çalışılan 152 klinik S.aureus izolatının yalnızca birinde ve pozitif kontrol olarak kullanılan S.aureus V329 suşunda bap geni saptanmıştır. icaADBC genleri tarafından sentez edilen PIA/PNAG’ın kemilüminesans dot blot yöntemiyle gösterilmesi için 50 adet klinik S.aureus izolatı kullanılmıştır. icaA ve icaD genleri pozitif olarak saptanan 42 izolatın tamamında dot-blot yöntemiyle PNAG üretimi gösterilirken, ica genleri negatif sekiz klinik izolatta PNAG tespit edilememiştir. Sonuç olarak, S.aureus izolatlarında biyofilm oluşumunun fenotipik olarak saptanmasında mikroplak yönteminin daha duyarlı ve güvenilir olduğu, klinik S.aureus izolatlarında biyofilm oluşturma düzeyinin yüksek olduğu (yaklaşık %80), icaA ve icaD genleri ve ürünlerinin (PIA/PNAG) biyofilm oluşumunda rol oynadığı gösterilmiştir.

Abstract

Staphylococcus aureus which is an important pathogen, is known to have several virulence factors. The pathogenicity of S.aureus isolates are related with features like adherence, various toxins, enzymes, structural and extracellular factors. Slime factor and biofilm formation are also the pathogenicity factors of the bacteria. Biofilm formation is usually associated with chronic infections and has become a subject of interest in a wide area of research. Biofilm is an adherent structure formed by bacteria encased within a matrix produced on natural body surfaces or medical devices. As the biofilm producing S.aureus isolates are more resistant to antibiotics and and their biofilms prevent phagocytosis, the treatment of infections caused by biofilm positive S.aureus isolates become difficult. The icaADBC locus and some proteins have provento be responsible for the formation of S.aureus type biofilm. The aim of this study was to investigate the relationship between the genotypic and phenotypic detection methods of biofilm formation with icaA, icaD and bap genes and phenotype expressions which are responsible for the formation of biofilm in S.aureus isolates. One hundred seventy five S.aureus isolates from various clinical specimens were included in the study. For the phenotypic detection of biofilm producing isolates Congo red agar (CRA) medium and microplate method were used. The biofilm-producing strain Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 and S. epidermidis ATCC 12228 were used as positive and negative controls, respectively. One hundred fifty two S.aureus biofilm producing isolates were detected at least by either Congo Red agar or microplate method and all isolates were screened for icaA, icaD and bap genes by PCR. The production of polysaccharide intracellular adhesins /poly-N-acetyl-beta-1-6–glucosamine (PIA/ PNAG) was also investigated in S.aureus isolates. For the detection of PIA/PNAG chemiluminescence dot-blot method was used. According to the phenotypic evaluations based on colony morphologies in CRA medium, biofilm formation were found as negative in 101 of 175 isolates (57.7%), while biofilm formation were positive in 74 (42.3%) of the isolates. As a result of quantitative evaluation by microplate method based on absorbance measurement, biofilm production was determined as negative in 34 (19.4%) specimens, moderate in 112 (64.0%) specimens and strong in 29 (16.6%) specimens.