İshalli Olgularda Microsporidia Sıklığının Calcofluor Beyazı ve Uvitex 2B Kemiluminesans Boyama Yöntemleriyle Araştırılması ve Türlerinin Moleküler Yöntemle Tiplendirilmesi

Özet

Zorunlu hücre içi paraziti olan Microsporidia, ilk kez 1857 yılında Nageli tarafından tanımlanmıştır. Microsporidia filumunda 200 cins ve 1500 tür bulunmaktadır. Microsporidia türlerinin böcekler, balıklar ve memeliler gibi geniş bir konak çeşitliliği bulunmaktadır. Hayvanlar dışında insanları da enfekte edebildiği ve insanlarda hem semptomatik hem de asemptomatik olarak bulunabildiği gösterilmiştir. İnsanı enfekte eden sekiz cins bulunmaktadır. Bu cinsler; Anncaliia (Brachiola, Nosema), Encephalitozoon, Entrocytozoon, Microsporidium, Nosema, Pleistophora, Trachipleistophora ve Vittaforma’dır. İnsanlarda en sık enfeksiyon oluşturan türler Encephalitozoon intestinalis ve Enterocytozoon bieneusi’dir. Bu çalışmada iki farklı kemiluminesans boya olan uvitex 2B ve calcoflour ile Microsporidia sıklığının belirlenmesi ve etken türlerinin moleküler olarak tiplendirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, 2012-2013 yılları arasında Gazi Üniversitesi Sağlık Uygulama ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı ile Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarına gönderilen ishalli 200 hastanın dışkı örnekleri incelenmiştir. Dışkı örnekleri kemiluminesan boya olan uvitex 2B ve calcoflour yöntemleriyle boyanmış ve floresan mikroskobu ile değerlendirme sonucunda Microsporidia sıklığı %38.5 (77/200) olarak saptanmıştır. Kemiluminesans boya olan uvitex 2B ve calcoflour arasında Microsporidia saptama açısından istatistiksel olarak mükemmel bir uyum olduğu belirlenmiştir (Cohen’s kappa= 0.881). Uvitex 2B ile calcoflour’un mikroskop sahasındaki Microsporidia sporlarının sayısal yoğunluğuna (az, çok) ve sporların parlaklıklarına (soluk, parlak) göre uyumlulukları istatistiksel olarak değerlendirildiğinde, iki boya arasında sporların sayısal yoğunluğunun saptanması açısından orta düzeyde uyum belirlenirken (Cohen’s kappa= 0.354), sporların parlaklıklarının belirlenmesi açısından herhangi bir uyum saptanmamıştır (Cohen’s Kappa= 0.001). Çalışmada Microsporidia sıklığının yaş grupları ve kliniklere göre dağılımında anlamlı bir fark belirlenmemiştir (p> 0.05). Cinsiyete göre ise Microsporidia sıklığının kadınlarda (%50) erkeklere (%30.8) göre daha fazla olduğu tespit edilmiştir (p 0.05). Bu çalışmada 70 adet Encephalitozoon spp.’nin 44’ü (%62.9) E.intestinalis, 22’si (%31.4) E.cuniculi ve dördü ise (%5.7) E.hellem olarak belirlenmiştir. Encephalitozoon türlerinin yaş, cinsiyet ve kliniklerine göre dağılımında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır (p> 0.05). Microsporidia tanısında ilk aşamada dışkı örneklerinin kemilüminesans boya olan uvitex 2B ve/ veya calcoflour boyama yöntemleriyle incelenmesinin yararlı olacağı sonucuna varılmış ve multipleks nested PCR yönteminin cins ve tür belirlenmesinde kullanılmasının yararlı olduğu gözlenmiştir. Ülkemizde dışkı örneklerinde Microsporidia prevalansının moleküler analizi ile ilgili az sayıda çalışma bulunmaktadır. İshalli olgularda tedavi seçeneklerinin değerlendirilmesi ve Microsporidia epidemiyolojisinin saptanması için moleküler yöntemler daha sık kullanılmalıdır.

Abstract

Microsporidia, obligate intracellular parasites, were first defined by Nageli in 1857. Microsporidia phylum consists of 200 genus and 1500 species. They have a wide host spectrum including insects, fish, and mammals. It has been shown that they may also infect humans and may be existed both in symptomatic and asymptomatic forms. There are eight species infecting humans, which include Anncaliia (Brachiola, Nosema), Encephalitozoon, Entrocytozoon, Microsporidium, Nosema, Pleistophora, Trachipleistophor, and Vittaforma. The species most commonly infect humans are Encephalitozoon intestinalis and Enterocytozoon bieneusi. The aim of this study was to determine the prevalence of Microsporidia by using two different chemiluminescence stains, namely uvitex 2B and calcoflour and detect species by molecular analysis in diarrheal patients. For this purpose, we studied stool samples of 200 patients with diarrhea sent to Gazi University Health Practice and Research Hospital, Microbiology Laboratory and Ankara Numune Training and Research Hospital Microbiology Laboratory between 2012-2013. The stool samples were stained with chemiluminescent stains uvitex 2B and calcoflour methods; the Microsporidia prevalence was found to be 38% (77/200) by fluorescent microscopic examination. Statistically an excellent consistency was found between the chemiluminescent stains uvitex 2B and calcoflour (Cohen’s kappa= 0.881). A statistical analysis for the consistency of uvitex 2B and calcoflour in terms of numerical density (low, high) and luminescence of spores (dim, bright) showed a moderate consistency between the two stains with respect to determining numerical density of spores (Cohen’s kappa= 0.354), while there was no consistency in terms of luminescence of spores (Cohen’s Kappa= 0.001). No significant difference was found between the Microsporidia prevalence with respect to age group or clinics (p > 0.05). A sex-based analysis showed that Microsporidia prevalence was more common in women (50%) than men (30.8%) (p 0.05). In our study 44 (62.9%) of 70 Encephalitozoon spp. were E.intestinalis, 22 (31.4%) were E.cuniculi, and 4 (5.7%) were E. hellem. No statistical difference was found in the distribution of Encephalitozoon spp. with age, sex, and referring clinic (p> 0.05). We concluded that examination of stool samples with the chemiluminescent stain uvitex 2B and/or calcoflour would be useful for the initial stage of Microsporidia diagnosis; furthermore, the multiplex nested PCR method was considered useful for determination of genus and species. In our country, there is a small number of molecular reports about Microsporidia prevalence in stool samples. Molecular methods should be used more commonly for the evaluation of treatment options in diarrheal patients and detection of Microsporidia epidemiology.