Kandan ve Kan Kültür Şişelerinden Brucella Saptanmasında İki Farklı Ticari DNA Ekstraksiyon Kiti ve PCR Master Miksinin Karşılaştırılması

Comparison of Two Commercial DNA Extraction Kits and PCR Master Mixes for the Detection of Brucella from Blood Samples and Blood Culture Bottles

Özet

Brusellozun tanısında klinik bulguları destekleyen kültür veya serolojik yöntemlere gereksinim duyulmaktadır. Bakterinin izolasyonu altın standart olarak kabul edilmekle birlikte, geç sonuç alınmakta ve pozitif kültürlerde yapılan çalışmalar laboratuvar kaynaklı bruselloz riski taşımaktadır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) prensibine dayanan yöntemler brusellozun erken tanısı ve laboratuvar kaynaklı bruselloz riskinin azaltılması bakımından yeni yaklaşımlar sunmaktadır. PCR yöntemlerinin tanıda kullanılabilmesi için klinik örnekten kaynaklanan inhibitörlerin DNA ekstraksiyonu aşamasında uzaklaştırılmış olması gerekmektedir. Bu çalışmada, doğrudan tam kanda ve kan kültür şişesinde gerçek zamanlı PCR (Rt-PCR) ile Brucella araştırılmasında, farklı DNA ekstraksiyon kitlerinin inhibitörleri uzaklaştırma performansları iki ayrı ticari PCR master miksi ile test edilerek, tanıda kullanılabilecek en uygun “ekstraksiyon kiti-PCR master miksi” kombinasyonunun belirlenmesi amaçlanmıştır. Brucella melitensis ATCC 23456 suşu kullanılarak hazırlanmış olan ve farklı sayılarda (102-104 cfu/ml) bakteri içeren 30 simüle kan örneği ve pozitif sinyal veren 10 kan kültür şişesi kullanılarak, iki farklı DNA ekstraksiyon kiti ve amplifikasyon master miksinin performansı değerlendirilmiştir. Ekstraksiyon kiti olarak; NORGEN Kan DNA izolasyon kiti (NORGEN) ve “Thermo Scientific GeneJet Whole blood genomic DNA purification kiti (Thermo)”; PCR master miksi olarak “QuantiTect multiplex PCR (QuantiTect)” (Qiagen, Hilden, Almanya) ve “Ampliqon Multiplex TEMPase (Ampliqon)” (Kopenhag, Danimarka) kullanılmıştır. Multipleks olarak uygulanan 160 adet Rt-PCR deneyinde Brucella spp., B.melitensis ve deney içi kontrol olarak da gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH)’a özgü primerler ve floresan boyalarla işaretli problar kullanılmıştır. Kandan ekstrakte edilen DNA örnekleri üzerinde yapılan 120 adet Rt-PCR çalışmasında GAPDH prob/primerleri örneklerin tamamında pozitif sonuç vermiştir. Brucella spp. için Rt-PCR’da pozitif bulunma yüzdeleri sırasıyla NORGEN-QuantiTect kombinasyonunda %96.7, Thermo-Ampliqon kombinasyonunda %93.3, Thermo-Quantitect kombinasyonunda %93.3 ve NORGEN-Ampliqon kombinasyonunda %86.7 olarak tespit edilmiştir. B.melitensis için bu değerler sırasıyla %96.7, %93.3, %56.7 ve %90 olarak bulunmuştur. Bakteri yoğunluğu 102 cfu/ml olan örneklerde Brucella spp. saptanma yüzdeleri Thermo-Ampliqon ve NORGEN-Ampliqon için %80, Thermo-QuantiTect ve NORGEN-QuantiTect için %90 olarak belirlenmiştir. B.melitensis varlığında elde edilen pozitif bulunma yüzdeleri ise sırasıyla %90, %70, %20 ve %90 olarak saptanmıştır. Norgen DNA izolasyon kiti kullanılarak kan kültürü şişelerinden elde edilen DNA örnekleri ile yapılan Rt-PCR çalışmaları %80 düzeyinde pozitif sonuç vermiştir. Fakat Thermo DNA ekstraksiyon kitiyle elde edilen DNA örneklerinde Rt-PCR pozitiflik düzeyi yalnızca %20 olarak saptanmıştır. Bu örneklerin %80’inde GAPDH için uygulanan PCR testi de negatif sonuç vermiştir. Çalışmanın sonuçları kandan ve kan kültürlerinden kaynaklanan inhibitörlerin uzaklaştırıldığından emin olmak ve örneklerde düşük seviyede mevcut olan Brucella bakterilerini dahi saptayabilmek için tanı amaçlı uygulanacak PCR temeline dayanan çalışmalarda; Norgen DNA ekstraksiyon kiti ile QuentiTect veya Ampliqon master miksi kombinasyonunun kullanılabileceğini göstermiştir.

Abstract

The diagnosis of human brucellosis requires culture or serological tests for the conformation of the clinical findings. Isolation of the bacteria is used as a gold standard, however it is time consuming and processing of positive cultures has a potential risk for laboratory acquired human brucellosis. Polymerase chain reaction (PCR) based methods have offered new approaches for early diagnosis of brucellosis and reduce the risk of laboratory acquired human brucellosis. A major limitation of the PCR method is the difficulty to remove the inhibitors in specimens. The aim of this study was to determine the performance of two DNA extraction kits by using two separate PCR master mixes and to determine appropriate “extraction kit - PCR master mix” combination for the diagnosis of Brucella from whole blood samples and blood culture bottles. Two commercial DNA extraction kits, NORGEN Blood DNA isolation kit (Norgen) and Thermo Scientific GeneJet Whole blood genomic DNA purification kit (Thermo Fisher Scientific, USA) and two PCR master mixes, QuantiTect multiplex PCR (QuentiTect, Qiager, Almanya) and Ampliqon Multiplex TEMPase (Amliqon, Denmark) were assessed on 30 simulated blood samples with known concentrations (102-104 cfu/ml) of Brucella melitensis ATCC 23456 strain and 10 blood culture bottles that gave positive signal. By using different combinations of extraction kits and PCR master mixes, a total of 160 different multiplex real-time PCR (Rt-PCR) trials were performed with probes and primers specific to Brucella spp., B.melitensis, and the internal control glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). All the 120 Rt-PCR trials performed on the DNA samples extracted from blood samples gave positive results with GAPDH probe/primers. The rate of positive PCR results for Brucella spp. was 96.7% for the combination of Norgen-QuantiTect, 93.3% for Thermo-Ampliqon, 93.3% for Thermo-QuantiTect, and 86.7% for Norgen-Ampliqon. The frequency of positive B.melitensis results for these combinations were 96.7%, 93.3%, 56.7% and 90%, respectively. In the samples with the bacterial density of 102 cfu/ml, Brucella spp. detection rates were 80% for Thermo-Ampliqon and Norgen- Ampliqon, and 90% for Thermo-QuantiTect and Norgen-QuantiTect; and for B.melitensis positivite rates were 90%, 70%, 20%, and 90%, respectively. Rt-PCR assays with the DNA samples extracted from blood culture bottles using Norgen isolation kit yielded 80% positivite result. However, the frequency of PCR positivite results was only 20% in the DNA samples extracted by Thermo DNA extraction kit. PCR result for GAPDH gene was also negative in 80% of the samples extracted by Thermo kit. Our results revealed that for the removal of inhibitors and detection of even low number of Brucella spp./B.melitensis in blood samples and blood culture bottles, NORGEN Blood DNA isolation kit can be used with a combination of QuantiTect multiplex PCR or Ampliqon Multiplex TEMPase