Klinik Örneklerden Mycobacterium tuberculosis Saptanmasında Anyplex MTB/NTM Testinin Değerlendirilmesi

Evaluation of Anyplex MTB/NTM Test for The Detection of Mycobacterium tuberculosis in Clinical Specimens

Özet

Klinik örneklerden Mycobacterium tuberculosis’in hızlı ve doğru bir şekilde saptanabilmesi, tüberkülozun etkin kontrolündeki en önemli basamaklardan biridir. Tüberkülozun erken ve doğru tanısı, tedavinin mümkün olan en kısa süre içerisinde başlatılabilmesini sağlamaktadır. Altın standart kültür yöntemlerine ek olarak, tüberkülozun erken tanısında hızlı sonuç veren moleküler yöntemlerin de tanı algoritmasına eklenmesi gerekmektedir. Bu nedenle son yıllarda tüberkülozun rutin tanısının yapıldığı laboratuvarlarda moleküler yöntemler önemli bir basamak haline gelmiştir. Bu çalışmanın amacı, rutin moleküler tanı laboratuvarlarında klinik örneklerden M.tuberculosis saptanması amacıyla kullanılmakta olan Anyplex MTB/ NTM testinin (Seegene, Güney Kore) hızlı tanıdaki etkinliğinin araştırılmasıdır. Çalışmada yanı sıra, yurt dışı kökenli ticari kitlere alternatif olabilecek yerli kitler üretebilmek amacıyla tasarlanmış olan primerlerin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemiyle ön değerlendirilmesinin yapılması hedeflenmiştir. Çalışmaya toplam üç yıllık süre içerisinde, tüberküloz şüphesi bulunan hastalardan elde edilerek laboratuvara gönderilmiş olan 10.652 klinik örnek dahil edilmiştir. Tüm örnekler boyama sonrasında mikroskobik inceleme, kültür ve gerçek zamanlı PCR (Rt-PCR) yöntemleri kullanılarak test edilmiştir. Hasta örneklerinden hazırlanan yaymalar aside dirençli basil varlığı açısından, Kinyoun boyama yöntemi ile boyandıktan sonra mikroskop ile incelenmiştir. Kültür amacıyla, örneklere N-asetil-L-sistein-sodyum hidroksit yöntemi ile homojenizasyon-dekontaminasyon işlemi uygulanmış, MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) şişelerine (Becton Dickinson, ABD) ve Löwenstein-Jensen besiyerine ekim yapılmıştır. Rt-PCR yöntemi ise Anyplex MTB/NTM testi ile gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın birinci aşamasında, tüberkülozun moleküler tanısında kullanılan Anyplex MTB/NTM testinin etkinliği, altın standart kültür yöntemiyle karşılaştırılarak değerlendirilmiştir. Bu amaçla seçilen 100 kültür-pozitif örneğe laboratuvar içi tasarımlı PCR yöntemi uygulanmıştır. Toplam 10.652 örneğin 178 (%1.7)’inde kültürde M.tuberculosis üremesi saptanmıştır. Altın standart kültür yöntemiyle yapılan karşılaştırma sonucunda Anyplex MTB/NTM testinin duyarlılık ve özgüllüğü akciğer kökenli örneklerde sırasıyla %84 ve %99, akciğer dışı örneklerde ise sırasıyla %74 ve %99 olarak bulunmuştur. Çalışmanın ikinci aşamasında ise, kültür sonucu pozitif olan örneklere, laboratuvar içi tasarımla oluşturulan primerlerin kullanıldığı PCR yöntemi uygulanarak, ileriki çalışmalarda geliştirilmesi planlanan laboratuvar yapımı tüberküloz tanı kitinde kullanımının uygun olup olmadığı araştırılmıştır. Bu amaçla seçilen 100 kültür pozitif örneğe laboratuvar içi tasarımlı PCR yöntemi uygulanmıştır. Bu örneklerin 98’inde kültür ile uyumlu pozitif sonuç elde edilirken, iki örnekte M.tuberculosis DNA’sı saptanmamıştır. Çalışma sonucunda Anyplex MTB/NTM testinin rutin tüberküloz tanısında kullanılabilecek hızlı, pratik ve güvenilir bir test olduğu sonucuna varılmıştır. Laboratuvar içi tasarıma sahip primerlerin kullanıldığı PCR yönteminin ön değerlendirme sonuçlarının rutinde kullanılan yöntemlerle uyumlu çıkması, daha uygun maliyetli yerli üretim tüberküloz moleküler tanı kitlerinin geliştirilmesine ışık tutacaktır. Böylece rutin tanı laboratuvarlarında hızlı tanının, daha uygun maliyetle gerçekleştirilmesi mümkün olacaktır.

Abstract

One of the most important steps for the control of tuberculosis is rapid and accurate detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples. The early and accurate diagnosis of tuberculosis allows the initiation of the effective treatment regimen as early as possible. However the early diagnosis of tuberculosis can be achieved by the integration of molecular methods into the diagnostic algorithm of tuberculosis together with the gold standard culture methods. For this reason, molecular methods have become valuable diagnostic tools in routine diagnostic laboratories in recent years. The aim of this study was to determine the diagnostic efficacy of Anyplex MTB/NTM test (Seegene, South Korea) used for the molecular diagnosis of tuberculosis in routine molecular diagnostic laboratories. In addition to this aim, a preliminary evaluation of in-house polymerase chain reaction (PCR) primers that was designed to produce a kit as an alternative against imported commercial kits was performed. Ten thousand six hundred fifthy two clinical specimens that were collected from suspected tuberculosis cases in three years were included in the study. All samples were tested by microscopic examination after staining, culture and real-time PCR (Rt-PCR) methods. The smears were examined by microscope after staining with Kinyoun method for the existence of acid resistant bacilli. For culture, following the N-acetyl-L-sistein-sodium hydroxide homogenization and decontamination procedure, the samples were inoculated into the MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) tubes (Becton Dickinson, USA). Rt-PCR method was performed by using Anyplex MTB/NTM test. In the first stage of the study, the performance of the Anyplex MTB/NTM test was compared with the gold standard culture method. M.tuberculosis was isolated in 178 specimens out of 10.652 (1.7%). After the comparison with the gold standard culture method, the sensitivity and specificity of Anyplex MTB/NTM test was found to be 84% and 99% respectively in pulmonary samples, and 74% and 99% respectively in extrapulmonary samples. In the second stage of the study, PCR method with laboratory designed primers was applied to 100 culture positive samples. The PCR results of 98 samples were found to be in agreement with the culture, while M.tuberculosis DNA was not detected in two samples. As a result of the study it was concluded that Anyplex MTB/NTM test is a rapid, practical and reliable method that can be used in routine tuberculosis diagnosis. The high agreement between PCR method using the laboratory-designed primers and the PCR method used in routine practice will lighten the way for the development of national tuberculosis molecular diagnostic kits with a relevant cost. In this way, it will be possible to perform rapid diagnosis in a more cost-effective manner in routine diagnosis laboratories.