Limbal stem cells in dogs and cats their identification culture and diferentiation into keratinocytes

Kedi ve köpeklerde limbal kök hücrelerin kültürü ve keratinositlere farklılaştırılması

İrem SANCAK GÜL,Asuman ÖZEN,Ferda Alpaslan PINARLI,Meral TİRYAKİ,Ahmet CEYLAN,UĞUR ACAR,Tuncay DELİBAŞI

Özet

Limbal epitel kök hücrelerin limbus olarak bilinen bölgede bulundukları kanıtlanmış olup normal ve hastalık durumlarında kornea epitelinin yenilenmesinden sorumludurlar. Korneanın damarsızlığının ve saydamlığının devamı, gözün homeostazisinin ve bütünlüğünün korunmasında önemli role sahiptir. Bu çalışmada kedi ve köpeklerin korneal hastalıklarının tedavisinde kulanılmak üzere keratinositlere farklılaştırılan limbal kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (LMSCs) farklılaşma potansiyelleri ve kültür özellikleri üzerinde durulmaktadır. Limbus kaynaklı mezenkimal kök hücreler gebe köpek (45 gün) ve kedilerin (35 gün) istenmeyen gebeliklerinin sonlandırılması ile elde edilen fötuslardan elde edilmiştir. Eksplant kültürler, kültür ortamında üçüncü pasaja kadar büyümeye bırakılmıştır. Keratinositlere farklılaştırılmış LMSCs desellülerize amniyotik membran (AM) üzerinde üç katman oluşumu sağlanana kadar üremeye bırakılmıştır. Hücrelerin karakterizasyonu her üç germ tabakasına (osteojenik, kondrojenik ve adipojenik) hücrelerin geçişi ile sağlanmıştır. Histoloji ve immonohistokimyasal analizler gerçekleştirilmiş ve korneada sitokeratin 19 (CK 19) ile pansitokeratinin pozitifiği gösterilmiştir. Keratinositlere ve her üç germ tabakasına dönüşüm başarı ile gerçekleştirilmiştir. Immunohistokimyasal olarak LMSCler hücre yüzey işaretleyicileri tespit edilmiş ve CD90, CD44 ve CD49 için pozitifik, CD45 ve CD11b\c için ise negatifikleri belirlenmiştir. LMSCler kornea dokusunun kendi hücreleri olması sebebiyle, ileriki çalışmalarda bu hücreler kullanılarak kornea onarımından daha iyi sonuçlar alınacağı düşünülmektedir.

Abstract

Limbal epithelial stem cells are the source of regeneration of the corneal epithelium in normal and diseased conditions and it is proven that they are located at the area known as limbus. Maintaining avascularity and clearity of the cornea is a crucial role in homeostasis and integrity of the eye. This study focuses on cats and dogs limbal derived mesenchymal stem cells (LMSCs) diferentiation potentials into keratinocytes for developing a culture model for corneal diseases. Limbus-derived mesenchymal stem cells were obtained from the limbus of terminated fetuses of the pregnant dogs (45 d) and cats (35 d). Explant cultures were allowed to grow in the culture medium untill 3 rd passage. LMSCs diferentiated into keratinocytes and allowed to grow into the decelularized amniotic membrane (AM) until three layer formation is maintained. Characterization was carried out by transition of cells from all three germ layers (osteogenic, chondrogenic and adipogenic). Histology and immunohistochemistry was carried out with cytokeratin 19 (CK 19) and pancytokeratin detected in the cornea. Three lineage diferentiation and keratinocyte transformation was succesfully maintained. Immunohistochemically LMSCs were confirmed for the cell surface markers and cells were positive for CD90, CD44 and CD49 and negative for CD45 and CD11b\c. LMSCs are potentially the native cells of the cornea and reconstruction of the cornea with these cells will have a better outcome.