Alfa tokoferol ve diğer güncel antifibrotiklerin, tek ve kombine kullanımda insan endotel hücreleri üzerine apoptotik etkilerinin in vitro incelenmesi

In vitro evaluation of apoptotic effects of single and combined use of alpha tocopherol and current antifibrotics, in human endothelium cells

Kaya N. ENGİN,Erdem Serap KURUCA,Özcan Gül ARICAN,Beyza ÇETİN,ERCAN ARICAN,Uğur SERBES,KADRİYE AKGÜN DAR,Sabriye KARADENİZLİ,Ayşegül KOPUCU

Özet

Amaç: Glokom cerrahisinde, fibroselüler skar formasyonunu önlemek için kullanılan güncel drogların endotel üzerine yan etkileri kullanımlarını sınırlamaktadır. -tokoferolün ise, -doğal bir antioksidan olmanın ötesinde, tenon fibroblast proliferasyonunu ve fibroselüler skar formasyonunu engelleyen, diğer antifibrotiklerin kullandığı yolaklara etkili bir nöromedyatör olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, -tokoferol ve diğer antifibrotiklerin insan endotel hücreleri üzerine in vivo kullanıma uygun dozlardaki apoptotik etkileri farklı kombinasyon ve sürelerde in vitro incelendi. Gereç ve Yöntem: ECV304 İnsan ulimbikal ven endotelyal hücre kültürlerinde antifibrotik ajanların etkileri; 5 dakikalık tek uygulama, ve 10 gün boyunca -tokoferol ilavesiyle kombine olarak incelendi. Antifibrotik ajan olarak paklitaksel, mitomisin, 5-FU ve -tokoferol kullanıldı. DAPI boyama ile floresans mikroskopunda apoptotik indeks tayin edildi. İmmunohistokimyasal yöntem ile hücrelerin kaspaz aktivitelerini incelenerek stoplazmik komponent değerlendirildi ve Reverse Transkriptaz-Polymerase Chain Reaction (PCR) tekniği kullanılarak bcl-2 ve bax gen ekspresyonları araştırıldı. Mitotik indeks tayini yapılarak hücrelerin proliferasyon eğilimleri belirlendi. Bulgular: Kısa ve uzun dönem apoptotik indeks değerleri mitomisin ve özellikle paklitakselde anlamlı yüksek bulundu. Mitomisinin etkisinin uzun dönemde tokoferol ilavesi ile anlamlı derecede arttığı gözlendi. Bcl-2/Bax oranınlarında artış ve kaspaz 3 aktivitesi de sadece mitomisin grubunda görüldü. Uzun dönem örneklerinde ise kaspaz 3 aktivitesi mitomisine ek olarak paklitaksel grubunda da görüldü. Kısa dönem mitotik indeks sonuçlarında -tokoferol, uzun dönemde ise paklitaxel+Tokoferol guruplarında anlamlı artış bulundu. Sonuç: -tokoferol’ün kombine kullanımı antifibrotiklerin endotel hücrelerindeki apoptotik etkilerini azaltmamıştır. Özellikle paklitaksel ve mitomisin ile olan additif etkisi incelenebilir. -tokoferol’ün ve 5-FU’in tek başına ve kombine uzun ve kısa süreli etkileri kontrol grubuna yakın olduğundan, kullanımları endotel toksisitesi açısından daha güvenlidir.

Abstract

Purpose: Side effects current antifibrotics on endothelium, limits their use in glaucoma surgery. The natural antioxidant, - tocopherol is also a neuromediator, and it not only prevents tenon’s fibroblast proliferation and fibrocellular scar formation, but effects similar pathways with those of other antifibrotics as well. In this study, apoptotic effects of -tocopherol and other antifibrotics -in concordant doses with their in vivo uses, on human endothelial cells were examined in vitro in various combinations and durations. Materials and Methods: Effects of antifibrotic agents in ECV304 Human Umblical Vein Endothelial Cell Cultures were evaluated in single 5 minnutes applications and in combination with 10 days of -tocopherol additions. Paclitaxel, mitomycin, 5-FU and -tocopherol were used as antifibrotic agents. Apoptotic indexes were found with DAPI staining in fluorescence microscope. Apoptotic cells were demonstrated immunohistochemically in preperates stained with peroxidase labeled caspase 3 monoclonal antibodies and bcl-2 ve bax gene expressions were evaluated with PCR. Mitotic indexes were determined to evaluate the proliferative trends. Results: Mitomycin and paclitaxel groups demonstrated a significant AI increase, which were augmented by -tocopherol addition. Either bcl-2/bax ratio decrease, or caspase activity were found only in Mitomycin group and further augmentation was achieved with -tocopherol addition. High proliferation was observed in tocopherol and paclitaxel+ tocopherol groups. Conclusion: Combination with -tocopherol did not reduce the apoptotic effects of antifibrotics on human endothelial cells. Single and combined uses of 5-FU and -tocopherol have been found to be safe for their long and short term effects were not statistically different from controls.