Detection and Molecular Characterization of ‘Candidatus Phytoplasma Trifolii’, a Member of the Clover Proliferation Grup, Infecting Tomato Plants from Iğdır Province in Turkey

Türkiye'de Iğdır İli Domates Bitkilerini Enfekte Eden Clover Proliferation Grup Üyesi Candidatus Phytoplasma Trifolii'nin Tespiti ve Moleküler Karakterizasyonu

Abstract

The tomato plant exhibiting leaf rolling, witches’ broom, distorted and elongated flower’s sepals inIğdır province, Turkey, was observed. Total DNA extraction was performed from the symtomaticfresh tomato sample. All DNAs were subjected to Direct and Nested polymerase chain reaction (PCR)with universal primer sets that amplified the 16S rRNA of phytoplasmas. PCR products were purifiedfrom agarose gel and cloned into the pGEM T-Easy cloning vector. Recombinant plasmids wereintroduced into the prokaryotic cloning bacteria by electroporation. Plasmid isolation was performedby selecting one of the positive clones randomly and sequencing was performed by Next GenerationSequencing (NGS). Sequencing results revealed that the 16S rRNA gene associated with phytoplasmawas 1251 nucleotides in size, and this sequence was denominated as ‘Iğdır 10’ isolates and recordedin the GenBank under the MT344968 accession number. The virtual restriction fragment lengthpolymorphism (V-RFLP) and phylogenetic analysis of the 16S rDNA sequence confirmed that thecause of disease in infected tomato plants was 'Candidatus Phytoplasma trifolii' ('Ca. P. trifolii')(16SrVI-A, Clover proliferation group), with a 1.00 similarity coefficient. This present study is thefirst report of ‘Ca. P. trifolii’ and its nucleotide sequence analysis in naturally infected tomato in Iğdırprovince.

Özet

Iğdır ilinde (Türkiye) şekli bozulmuş ve uzamış çiçek taç yaprakları, yaprak kıvrılması ve cadı süpürgesi simptomları sergileyen domates bitkisi görülmüştür. Belirti gösteren taze dometes örneklerinden toplam DNA extraksiyonu yapılmıştır. Tüm DNA'lar fitoplazmaların 16S rRNA'sını amplifiye eden spesifik üniversal primer setleri ile Direct ve Nested polimeraz zincir reaksiyonuna tabi tutulmuştur. PCR ürünleri agaroz jelden saflaştırılmış ve pGEM T-Easy klonlama vektörüne klonlanmıştır. Rekombinat plazmidler, prokaryotik klonlama bakterisine elektroporasyon ile aktarılmıştır. Pozitif klonlardan rastgele birisi seçilerek plazmid izolasyonu ve akabinde yeni nesil dizileme (NGS) ile dizileme gerçekleştirilmiştir. Dizileme sonuçları, fitoplazma ile ilişkili 16S rRNA geninin 1251 nükleotit uzunluğunda olduğunu ortaya çıkarmış ve bu dizi ‘Iğdır 10’ olarak isimlendirilerek MT344968 ulaşım numarası ile gen bankasına kaydedilmiştir. 16S rDNA dizisinin virtual restriction fragment length polymorphism (V-RFLP) ve filogenetik analizleri, infekteli domates bitkilerinde hastalık nedeni ajanın 1.00 benzerlik katsayısı ile ‘Candidatus Phytoplasma trifolii’ (16SrVI-A, Clover proliferation grup) olduğunu doğrulamıştır. Mevcut bu çalışma, Iğdır ilinde doğal olarak enfektelenmiş domates bitkisinde "Ca. P. trifolii" nin ve onun nükleotit dizi analizinin ilk raporudur