Method Verification Study for Detection of Cryptosporidium spp. by Realtime PCR Method

Cryptosporidium spp.’nin Realtime PCR Yöntemi ile Saptanması İçin Metot Verifikasyon Çalışması

Abstract

Objective: Cryptosporidium spp. is an important parasite, especially among the causes of foodborne and waterborne diarrhea. The aim of this study was to verify the molecular method used for routine diagnosis of Cryptosporidium spp. in stool samples. Methods: For this purpose, Cryptosporidium parvum positive calf stool sample was diluted with PBS and oocysts were counted using Cryptosporidium/Giardia direct fluorescein antibody assay. DNA extraction from the same sample was carried out using a commercial kit after determining the number of oocysts in the sample. PCR amplification was performed using multiplex PCR assay for molecular detection of Cryptosporidium spp., Giardia intestinalis, Entamoeba histolytica, Dientamoeba fragilis in the DNA sample retrieved. Results: The detection limit was determined as 8 oocysts/reaction. Then, high and low positive samples were prepared, and accuracy and precision studies of the method were performed by two different analysts to complete verification analysis of the test method. Conclusion: Since variation coefficients of method verification studies were below 15%, it was decided that the test was suitable for investigation of Cryptosporidium spp. in routine patient samples.

Özet

Amaç: Cryptosporidium spp. özellikle gıda ve su kaynaklı ishal nedenleri arasındaönemli bir parazittir. Bu çalışmada, dışkı örneklerinde Cryptosporidium spp.’nin rutintanısında kullanılan moleküler yöntemin metod verifikasyonunun yapılması amaçlanmıştır.Yöntem: Bu amaçla Cryptosporidium parvum pozitif buzağı dışkı örneği PBS ile dilüeedilmiş ve Cryptosporidium/Giardia direkt floresan antikor kiti kullanılarak ookist sayımı yapılmıştır. Aynı örneğe ticari kit ile DNA ekstraksiyonu uygulanmıştır. Elde edilenDNA örneği kullanılarak Cryptosporidium spp., Giardia intestinalis, Entamoeba histolytica,Dientamoeba fragilis’in moleküler yöntemlerle saptanması için multipleks PCR kitikullanılarak PCR amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir.Bulgular: PCR’ın saptama limiti 8 ookist/reaksiyon olarak belirlenmiştir. Daha sonrayüksek ve düşük pozitif örnekler hazırlanmış, iki farklı analist ile doğruluk ve kesinlikçalışmaları yapılarak testin metot verifikasyonu tamamlanmıştır.Sonuç: Metod verifikasyon çalışmalarının varyasyon katsayıları %15’in altında olduğuiçin testin, rutin hasta örneklerinde Cryptosporidium’un araştırılmasına uygun olduğuna karar verilmiştir.