In vitro transcription of the Fasciola hepatica Cathepsine L1 gene (Preliminary study)

In vitro transkripsiyonla Fasciola hepatica Cathepsin L1 RNA'sının elde edilmesi (Ön çalışma)

Mustafa KAPLAN, Kutbettin DEMİRDAĞ, Aykut ÖZDARENDELİ, Ahmet KALKAN, Salih KUK

Abstract

The aim of this study was to evaluate the in vitro transcription of the F hepatica cathepsine L1 gene. For this purpose, mature F. hepatica was obtained from the bile ducts of a bovine liver. For the performance of reverse transcription (RT) and the polymerase chain reaction (PCR), the primers, FhP1 and FhP2, were designed according to Genbank EMBL L33771. Amplicons of 981 bp were amplified with RT-PCR. The F. hepatica cathepsine Ll gene was cloned into the pCI-neo mammalian expression vector that contains the TY promoter site where in vitro transcription takes place and was transferred into E. coli JM 109 competent cells. The plasmid DNA was obtained by the alkalilysis method. After linearization of the plasmid DNA, in vitro transcription was performed according to the riboprobe in vitro transcription system. RNA transcripts were run on 1.5% agarose gel and visualized under UV light. In conclusion, we were able to get RNA transcripts by in vitro transcription from the plasmid DNA that harbors the F. hepatica cathepsine L1 gene. This study will allow us to work further on in vitro translation and translational control of the F. hepatica cathepsine Ll gene.

Özet

Bu çalışmada in vitro translasyonla cathepsin L1 proteini elde edilmesine temel oluşturmak için, F. hepatica cathepsin L1 geninin T7 promotor bölgesi bulunan bir plazmide klonlanması ve in vitro transkripsiyonla cathepsin L1 RNA'sının elde edilmesi amaçlanmıştır. Yetişkin F. hepatica, doğal olarak infekte sığır karaciğerinin safra yollarından elde edildi. Tersine transkripsiyon (TT) ve polimeraz zincir reaksiyonu (PZR)'de kullanılan primerler (FhP1 ve FhP2) Genbank EMBL L33771'den yararlanılarak dizayn edildi. M-MLV RT enzimi kullanılarak TT ile elde edilen cDNA, PZR ile çoğaltıldı. 981 baz çifti (bp) büyüklüğündeki PZR ürünü pCI-neo Mammalian Expression vektörüne yerleştirildi. Vektör kompetan E. coli JM 109 hücrelerine transforme edildi. İn vitro transkripsiyon işlemi Riboprobe in vitro Transcription Systems ile yapıldı. F. hepatica toplanı RNA'sından TT ile elde edilen 981 bazlık F. hepatica'nın cathepsin L1 cDNA'sı, rekombinant plazmid ve in vitro transkripsiyon işlemi ile DNA'dan elde edilen RNA etidyum bronıidle boyanmış agaroz jelde gösterildi. Sonuç olarak, bu çalışmada in vitro transkripsiyonla elde edilen RNA, cathepsin L1 RNA'sı, cathepsin L1 gen regülasyonu ve translasyon mekanizması üzerinde gelecekte yapılacak olan çalışmalarımıza temel oluşturması açısından önem arz etmektedir.