Az sayıdaki eimeria ookistlerinden toplam nükleik asit eldesi için yeni bir metod

A novel procedure for total nucleic acid extraction from small numbers of eimeria species oocysts

Abstract

A series of experiments were performed in an attempt to extract genomic DNA from a small number of Eimerian oocysts. Sonication, ammonia, ethanol and lysozyme were all found to be unsuitable for the digestion of Eimeria oocysts. The chemicals and enzyme given were not capable of either disruption or digestion of oocysts for nucleic acid extraction. They had the capability of penetrating the oocyst wall but could not break-up the oocyst wall. It is impossible to obtain nucleic acid from Eimeria oocysts if the wall is not broken-up. In this study oocyst disruption was achieved using a simple but highly effective treatment regime involving sodium hypochlorite treatment, osmotic shock and proteinase K digestion. Following the disruption of the oocyst walls, a commercially available nucleic acid purification kit (Wizard® DNA Purification Kit, Promega) can be used to prepare high quality nucleic acid.

Özet

Az sayıdaki Eimeria ookistinden DNA ektraksiyonu için bir seri deneme yapıldı. Sonikasyon, amonyum, ethanol ve lizozim kullanılan denemeler Eimeria ookistlerini parçalamak için uygun olmadıkları tespit edildi. Bu kimyasalların, nükleik asit ektraksiyonu için ookistleri parçalama ya da sindirebilme özelliklerinin olmadığı belirlendi. Bazılarının ookist duvarından geçebildikleri ancak ookist duvarını parçalayamadıkları belilendi. Ookist duvarı dağılmadan içerisindeki DNA'nın elde edilmesi imkansızdır. Ookist duvarının iç katmanı proteinden yapılmış olmakla beraber Proteinaz K sindirimi etkisiz kalmaktadır. Ookist duvarının, dış faktörlere karşı koruyucu etki gösteren özel bir yapıya sahip olabileceği kabul edilmektedir. Bu makale, Eimeria ookistlerinden yüksek kalitede total nükleik asit eldesi için uygun olan basit prosedurü açıklamaktadır. Bu prosedürde, oldukça basit fakat etkili sodyum hipoklorit, ozmotik şok ve proteinaz K sindirimi işlemlerini içeren bir uygulama ile ookist duvarının parçalaması sağlanmıştır. Ookist parçalanmasını takiben ticari olarak satılan nükleik asit ekstraksiton kitleri de (Wizard® DNA Purification Kit, Promega) yüksek kalitede nükleik asit eldesi için kullanılabilmektedir.