Cryopreservation of Leishmania Species in Manisa Province

Manisa İlimizde Görülen Leishmaniasis Etkeni Leishmania Türlerinin Kriyoprezervasyonu

Abstract

Objective: It was aimed to assess the success of the cryopreservation process which is carried out in order to preserve the genetic material and the virulence of the Leishmania species that are an important health problem in our region. Methods: Leishmania tropica, L. infantum, L. major, and L. donovani strains in Novy-MacNeal-Nicolle (NNN) medium in MCBU were used. Promastigotes cultured in the NNN medium were transferred to RPMI 1640 medium; promastigotes in the logarithmic phase were washed three times with PBS, and 15% dimethylsulfoxide (DMSO) was added. Leishmania species were transferred to 12 separate tubes. The tubes were stored at −86°C for one night by placing them in Coolcell boxes. The tubes were transferred into a liquid nitrogen tank. One cryotube per Leishmania strain is thawed monthly and cultured in NNN medium. Results: For the duration of study it was observed that each Leishmania isolate preserved 60-65% of their viability and entered the logarith- mic phase on the 7 th day following the inoculation in the NNN medium. Abnormalities in the structures and movements of the promastigotes were not observed in microscopic examinations. Conclusion: The following conclusions were made: cryopreservation is important for studies planned related to leishmaniasis and cryopres- ervation with DMSO is successful.

Özet

Amaç: Coğrafyamızda önemli bir sağlık problemi nedeni olan Leishmania türlerinin virülansının ve genetik materyalinin korunması için yapı-lacak kriyoprezervasyon yönteminin sağlıklı işleyip işlemediğinin gözlenmesi amaçlanmıştır.Yöntemler: Manisa Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı’nda Novy-MacNeal-Nicolle (NNN) besiyerlerindeardışık pasajlarla devam eden Leishmania tropica, L. infantum, L. major ve L. donovani suşları kullanılmıştır. NNN besiyerinde kültürü yapılanpromastigotlar RPMI 1640 sıvı besiyerlerine aktarılmış ve logaritmik faza giren promastigotlar fosfat tampon solüsyonu (PBS) ile 3 defa yıkan-mıştır. Promastigot sayısı 10 8 mL/promastigot olarak ayarlanmış ve üzerine %15 Dimetilsülfoksit (DMSO) eklenmiştir. Leishmania türlerinin herbiri 12 ayrı steril kriyo tüplerine aktarılmıştır. Tüpler Coolcell kutularına yerleştirilerek -86°C’de bir gece bekletilmiştir. Ertesi gün hızlı bir şekildetüpler sıvı azot tankına aktarılmıştır. Sıvı azot tankına aktarılan kriyo tüpleri birer ay ara ile her Leishmania türünden birer adet çıkarılarak uygunşekilde çözündürülmüş ve NNN besiyerlerine ekimleri yapılmıştır.Bulgular: Çalışma süresince her ay sıvı azot tankından çıkarılan Leishmania izolatlarının her birinin % 60-65 oranında canlılıklarını koruduğu veNNN besiyerlerine yapılan ekimlerinde promastigotların 7.günde logaritmik faza girdiği gözlenmiştir. Mikroskop incelemelerinde promasti-got yapılarında ve hareketlerinde anormallikler gözlenmemiştir.Sonuç: Çalışmamızda leishmanisis ile ilgili yapılması planlanan araştırmalarda kriyoprezervasyonun önemli olduğu ve DMSO ile yapılan kri-yoprezervasyonun başarılı olduğu kanısına varılmıştır.