Morphological, biochemical and molecular characterization of Bacillus isolates as a producer of industrial enzymes

Endüstriyel enzimler üreten Bacillus izolatlarının morfolojik, biyokimyasal ve moleküler yöntemlerle karakterizasyonu

Abstract

Objective: The identification of Bacillus strains which are genetically related have become difficult. The aim of this study was to characterize the closely related groups of species by making comparisons. The industrial use of isolates that have been identified by molecular methods and their phenotypic properties documented have also been examined. Methods: Soil samples were collected from different locations in Kocaeli town (Kocaeli University Campus, fields and creeks on Yuvacık Dam Road, Kent Forest), spread onto nutrient agar plates after pasteurization process followed by serial dilutions. Bacilli-like colonies were isolated according to their morphological characters. Individual colonies from each site were picked up, purified by re-streaking and numbered. Among a number of isolates, the ones belonging to Bacillus genus were subjected to 16S ribosomal RNA (16S rRNA) gene sequencing which is widely practiced technique due to the slow rates of evolution of this region of the gene. To discriminate the members of closely relaxed taxa, additional molecular (restriction digestion of gyrB gene with Sau3AI enzyme) and biochemical analyses (growth in selective media) were performed. Phylogenetic trees were constructed using the neighbor-joining method. The isolated were also analyzed in terms of their tolerance against different physiological conditions and the biochemical characteristics of them were compared with reference strains. Results: 7 different isolates (Y1; B. cereus, Y7; B. pumilus, Y12; B. megaterium; Y13; B. methylotrophicus, Y15; B. subtilis, Y35; B. licheniformis, Y38; B. sonorensis) have been identified to species level and physiological characteristics of each have been documented. Accordingly, all isolates were able to grow at temperatures from 30 to 45°C and pH 9. The isolates numbered as Y7, Y15, Y35 and Y38 were observed to tolerate temperatures up to 50°C. Among all, B. licheniformis numbered as Y35 presented the highest tolerance to salt concentration of 12% (w/v). The most sensitive ones to salt were B. cereus and B. megaterium numbered as Y1 and Y12, respectively. Those isolates did not grow in the presence of 5% (w/v) NaCl concentration. Conclusion: The 16S rRNA and gyrB genes, selected to identify the isolates, have been proven to be used for classification of Bacilli at molecular level. Biochemical tests confirmed the molecular analysis outcomes. Temperature, pH and salt tolerance of the isolates were compared with the Bacillus species already used in industry. Many of them presented similar growth potential against to the physiological conditions tested. On the other hand, the isolate Y1 was found to show ability to grow broad pH range than those reported for B. cereus. The capability of a soil B. licheniformis, isolate Y35, to grow in medium with high salt (12%, w/v) was presented for the first time. In summary, the isolated and identified Bacillus species here are believed to promote many studies including novel enzyme, toxin and pharmaceutically important compound production in industrial biotechnology field.

Özet

Amaç: Bacillus cinsine ait türlerin tanımlanmasındatürler arasındaki moleküler benzerliklerin fazla olmasınedeniyle ayrım zorlaşmaktadır. Bu çalışma kapsamında,özellikle birbiriyle yakın akraba olan gruplar arasındakarşılaştırma yaparak türlerin karakterize edilmesiamaçlanmıştır. Moleküler tanımlaması yapılan ve fenotipiközellikleri belirlenen izolatların endüstriyel kullanımlarıda ayrıca irdelenmiştir.Yöntem: Kocaeli ilinin farklı bölgelerinden(Kocaeli Üniversitesi Kampüsü Kent Ormanı, YuvacıkBaraj Yolu üzerindeki tarlalar ve dere kenarı) alınantoprak örnekleri pastörizasyon işleminden sonra seriseyreltmeler hazırlanarak nutrient agar plaklara yaymaekim yapılmıştır. Bacillus benzeri koloniler morfolojikkarakterlerine göre tek tek seçilip tekrar yayma ekimlesaflaştırılmış ve numaralandırılmıştır. Bacillus cinsineait olanlarda önce korunmuş bir gen bölgesi olan vesınıflandırmada yaygın olarak kullanılan 16S ribozomalRNA (16S rRNA) gen dizi analizi gerçekleştirilmiştir. Yakınakraba olanları birbirinden ayırmak için ilave moleküler(gyrB gen bölgesinin Sau3AI enzimi ile muamele edilmesi)ve biyokimyasal (seçici besiyerlerinde gelişme) analizleryapılmıştır. Filogenetik analizler NJ (neighbour joining)metodu ile gerçekleştirilmiştir. İzolatlar ayrıca fizyolojiközellikleri açısından karşılaştırılmıştır.Bulgular: İzolatlara ait yedi farklı Bacillus türü (Y1:B. cereus, Y7: B. pumilus, Y12: B. megaterium, Y13: B.methylotrophicus, Y15: B. subtilis, Y35: B. licheniformisve Y38: B. sonorensis) tanımlanmış ve her bir izolatınfizyolojik özellikleri kaydedilmiştir. Buna göre tümizolatlar 30 ila 45°C sıcaklık aralığında ve pH’sı 9 olan besiortamında gelişme göstermiştir. Diğer yandan Y7, Y15, Y35ve Y38 numaralı izolatlar 50°C’ye kadar olan sıcaklıklardabüyüme yeteneklerini korumuşlardır. Aralarında tuzaen fazla tolerans gösterenin B. licheniformis olaraktanımlanmış olan Y35 numaralı izolat olduğu gözlenmiştir.Bu izolat yaklaşık %12 (w/v) oranında tuz içeren ortamdagelişebilmektedir. Tuza karşı duyarlılığı en fazla olanizolatlar ise B. cereus ve B. megaterium olarak tanımlananY1 ve Y12 numaralı izolatlar olup büyümelerinin %5’lik(w/v) NaCl’da durduğu kaydedilmiştir.Sonuç: Yapılan bu çalışmada izolatların türtanımlanması için seçilen 16S rRNA ve gyrB genbölgelerinin, Bacillus’ların moleküler düzeyde ayırımındakullanılabileceği gösterilmiştir. Gerçekleştirilenbiyokimyasal testler, moleküler analiz bulgularınıdesteklemiştir. İzolatların sıcaklık, pH ve tuz toleranslarıendüstride hali hazırda kullanılan Bacillus’larlakarşılaştırılmış ve birçoğunun benzer fizyolojik koşullardagelişme gösterdiği gözlenmiştir. Diğer yandan, izolatlardanY1’in literatürde rapor edilen B. cereus suşlarından dahageniş bir pH aralığında gelişme gösterdiği bulunmuştur. B.licheniformis olarak tanımlanmış Y35 izolatında gözlenenyüksek tuz konsantrasyonu (%12, w/v) içeren ortamlardagelişebilme yeteneği ise toprak Bacillus’larında ilk defabu çalışmada sunulmuştur. Sonuç olarak, Y1 ve Y35 baştaolmak üzere tür tanımlaması yapılan tüm izolatlarınendüstriyel biyoteknoloji alanında özgün enzim ya datoksin üretimi, ilaç hammadde sentezi gibi veya benzeriçalışmaların yapılmasına olanak sağlayabilecekleridüşünülmektedir.