Partial purification of sheep liver alkaline phosphatase, investigation of physicochemical and kinetic properties

Koyun karaciğer alkali fosfatazının kısmen saflaştırılması, fizikokimyasal ve kinetik özelliklerinin araştırılması

Abstract

In this study, alkaline phosphatase (ALP) enzyme was partially purified from sheep liver and its physicochemical and kinetic properties were investigated. Spesific activity of enzyme was found 0.843 lU/mg protein which had been purified 18,32 fold from sheep liver. Purification procedures include homogenization, N-Butanol extraction, acetone and precipitation stages with ethanol-chloroform. In a medium of 25 °C and pH 10.5, Michaelis-Menten and Lineweaver-Burk graphics of the partially purified enzyme in 0.1 mM Glycine-Magnesium buffer against p-Nitrophenylphosphate (p-NPP) substrate were drawn up, and Km value was calculated as 0.31mM. The effect of temperature, pH, L-Histidine, Thiourea and phosphate on enzyme activity was investigated. It was observed that activity of the enzyme decreased with time at 56 °C, and 96.5 % of this activity disappeared at the end of 30 minutes. At 65 °C, however, almost all of the activity was noticed to disappear in the first 5 minutes. The optimum pH of enzyme was determined to be 10.4 for p-NPP. The last product phosphate was observed to inhibit enzyme, and L-Histidine was determined to lead to un-competitive inhibition. It was identified that thiourea had no effect on enzyme activity.

Özet

Bu çalışmada alkali fosfataz (ALP) enzimi koyun karaciğerinden kısmen saflaştırılarak kinetik ve fizikokimyasal özellikleri incelenmiştir. Koyun karaciğerinden 18.32 kat saflaştırılmış enzimin spesifik aktivitesi 0,843 İU/mg protein olarak bulundu. Saflaştırma işlemleri, homojenizasyon, N-Butanol ekstraksiyonu, aseton ve etanol-kloroformla çöktürme basamaklarını içermektedir. Kısmen saflaştırılan enzimin 25°C'de, 0.1 mM Glisin-Magnezyuın tamponunda (pH 10.5), p-Nitrofenilfosfat (p-NPP) substratına karşı Michaelis-Menten ve Lineweaver-Burk grafikleri çizilerek Kın değeri 0,31 mM olarak hesaplandı. Daha sonra sıcaklık, pH, L-Histidin, Tiyoüre ve Fosfat' in enzim aktivitesi üzerine etkisi araştırıldı. Enzimin 56 °C de zamanla aktivitesinin azaldığı ve 30 dakika sonunda aktivitesinin % 96.5' ini kaybettiği gözlendi. 65 °C sıcaklıkta ise ilk 5 dakikada aktivitenin hemen hemen tamamının kaybedildiği gözlenmiştir. Enzimin p-NPP için optimum pH' sı 10.4 olarak bulunmuştur. Son ürün olan fosfatın enzimi inhibe ettiği, L-Histidin'in unkompetitif inhibisyona yol açtığı gözlenmiştir. Tiyoüre'nin ise enzim aktivitesi üzerine hiçbir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir.