Meldola mavisinin sülfidril grupları ile tepkime yatkınlığı: Analitik ve biyomedikal bağlamda değerlendirmeler]

Reactivity of meldola blue towards sulfhydryl groups: Analytical and biomedical aspects

Abstract

ABSTRACTThe reactivity of meldola blue (CI 51175; MB), a phenoxazine redox dye employed in biosensors, towards reduced glutathione (GSH) and protein-SH groups was studied at 25°C in 50 mM MOPS buffer, pH 8.0, containing 25-80 µM MB and (a) GSH (0.25-8 mM), (b) 3-mercaptopropionic acid (3-MPA, 8 mM) or (c) chicken liver sorbitol dehydrogenase (SDH, 40 mU/ml). The reactions were monitored spectrophotometrically at 570 nm (a and b) or 340 nm (c). GSH caused a triphasic change in the spectral properties of MB, pointing to rapid preliminary formation of an adduct (Phase I; Kd = 1.2 mM, r2 = 0.9994), followed by 2 GSH-dependent (pseudofirst-order) processes (Phases II and III). Phase II was appeared to involve cleavage of the oxazine ring and had a limiting rate constant of 0.45 min-1. Phase III was a slower process with k in the hr-1 range. The reaction pattern of the dye with 3-MPA was similar to that with GSH. The reaction with SDH, monitored through the change in enzymatic activity in the presence of 300 mM fructose and 0.2 mM NADH, was fast (kobserved ≥ 3.5 min-1 at 80 µM MB) and resulted in inactivation of the enzyme. The results point to the reactivity of MB with SH groups as a significant drawback in dye-mediated analyses using unfractionated biological samples and in amperometric systems based on SH-containing indicator enzymes.

Özet

ÖZETBiyoalgılayıcı tasarımında kullanılan ve indirgenme-yükseltgenme tepkimelerinde etkili, fenoksazin yapılı bir boya olan meldola mavisinin (meldola blue, CI 51175; MB) indirgenmiş glutatyon (GSH) ve protein-SH gruplarıyla tepkime yatkınlığı, 25°C’de, 50 mM MOPS (pH 8.0) tamponunda incelendi. MB’nin (25 –80 µM) (a) 0.25-8 mM GSH, (b) 8 mM 3-merkaptopropionik asit (3-MPA) ve (c) tavuk karaciğeri sorbitol dehidrogenazı (SDH; 40 mU/ml) ile tepkimeleri, spektrofotometrik olarak izlendi (λ = a ve b sisteminde, 570 nm; c sisteminde 340 nm). GSH, MB’nin spektral özelliklerinde üç aşamalı değişime yol açtı. Hızla gelişen ilk aşamada bir eklenme ürünü oluştuğu (Faz I; Kd = 1.2 mM, r2 = 0.9994); ilk değişimi, GSH derişimine bağımlı ve görünür birinci dereceden kinetik sergileyen 2 sürecin izlediği (Faz II ve Faz III) görüldü. Hız sabiti üst sınırı 0.45 dak-1 düzeyinde olan Faz II sürecinin oksazin halkasının açılmasını yansıttığı düşünüldü. Daha yavaş seyreden Faz III’te k değerleri saat-1 boyutundaydı. Boyanın 3-MPA ile tepkime düzeni, GSH tepkimelerine benzer özellikler gösterdi. SDH ile tepkime, enzim etkinliğindeki değişiklik üzerinden izlendi; 300 mM fruktoz ve 0.2 mM NADH varlığında, etkinliğin hızla yok olduğu görüldü. (80 µM MB ile gözlenen k ≥ 3.5 dak-1). Sonuçlar MB’nin SH gruplarıyla tepkime yatkınlığının, ön-kesitleme yapılmamış biyolojik örneklerin analizinde ve SH içerikli algılayıcı enzimlere dayalı boya-aracılı amperometrik düzeneklerde önemli sorunlara yol açabileceğini gösterdi.