Quantitation of total and reduced glutathione in erythrocytes by high performance liquid chromatography

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile eritrositlerde toplam ve indirgenmiş glutatyon miktarının tayini

Mehtap Yüksel EĞRİLMEZ, Zahide ÇAVDAR, Gül GÜNER, Semra KOÇTÜRK, Memduh BÜLBÜL

Abstract

Glutathione is the main non-protein thiol compound present in mammalian cells in millimolar level. Glutathione which is a tripeptide functions as a principle reducing agent in biological systems. The most important function of this tripeptide is to maintain intracellular redox status and to protect cells from reactive oxygen species. It is also involved in physiological processes such as synthesis of DNA and transport of amino acids. This study was carried out to optimize the most suitable conditions for quantitation of total and reduced glutathione in erythrocytes by High Performance Liquid Chromatography. In our study, the most suitable composition of acetonitrile+acetate buffer and the flow rate for the ideal elution of glutathione were determined by evaluating the number of theoretical plate, capacity factor, peak asymmetry and resolution values, indicating the system and method performance. In addition, intra and inter assay reproducibility and recovery studies were done. The results obtained from this study provided an improved method for glutathione determination by High Performance Liquid Chromatography. Since this method is faster than the most commonly used methods and it also permits better reproducibility and high sensitivity, thus it is suggested that this method can be used confidently to determine the amount of glutathione in biologic samples.

Özet

Glutatyon; memeli hücrelerinde milimolar düzeyinde bulunan, başlıca protein olmayan bir tiyol bileşiğidir. Bir tripeptid olan glutatyon, temel biyolojik indirgeme reaktifi olarak görev alır. Bu tripeptidin önemli görevleri; hücre içi redoks dengesini sağlamak ve hücreleri reaktif oksijen türevlerinden korumaktır. Ayrıca DNA sentezi ve amino asitlerin taşınması gibi fizyolojik süreçlerde de görev almaktadır. Bu çalışma, eritrosit toplam (indirgenmiş+oksitlenmiş glutatyon) ve indirgenmiş glutatyonun Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi ile analizi için en uygun koşulların saptanması amacıyla gerçekleştirilmiştir. Çalışmamızda glutatyonun ideal elüsyonu için en uygun asetonitril+asetat tampon karışımının oranı ve akış hızı, sistemin ve yöntemin performansını belirleyen teorik tabaka sayısı, kapasite faktörü, pik asimetrisi ve ayırıcılık değerleri göz önünde bulundurularak saptanmıştır. Bunun yanında gün-içi ve günler-arası tekrarlanabilirlik ve geri kazanım çalışmaları ile yöntem performansı incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi ile glutatyon ölçüm yönteminin geliştirilmesini sağlamıştır. Bu yöntemin hızlı, tekrarlanabilir ve yüksek duyarlılıkta olması nedeni ile biyolojik örneklerdeki glutatyon analizinde güvenilirlikle kullanılabileceği öngörülmüştür.