PKC stimulation increases expression of cholinesterases in R28 cell line

Abstract

Objective: Previously we have shown a counter-regulation between cholinesterases (ChEs) through both anti-sense Butyrylcholinesterase (BChE) transfection and knock-down by siRNAs in R28 cells. In course of this counter-regulation, the status of the cell growth- and differentiation-related signaling pathways PKC and ERK were also changed. Down-regulation of BChE led to an increased PKC-α expression. Here, we demonstrate that this interaction between ChEs and PKC is reciprocal. Methods: R28 cells were treated with final 10 µM Di-octanoyl glycerol (DOG) and 10 nM siRNAs against BChE. Expression analysis was done by RT-PCR, Western Blot, IHC and activity assays. Results: DOG treatment along with BChE knockdown resulted in increased PKC-α expression, as compared with DOG treatment alone. Change in ERK1 expression was not as profound. In R28 cells, DOG stimulation led to marked rapid increase in both AChE and BChE expression.Conclusion: PKC stimulation during BChE knockdown caused functional, saturated AChE expression. Increased PKC-α expression suggests that PKC-α is not only regulated by its stimulators but also by the absence of BChE. While ChEs are counter-regulated, activation of PKC has both reciprocal and additive outcome through cholinergic pathway. Thus, effects of DOG stimulation expose yet another interaction between calcium dependent PKC-α and ChEs showing that any measure of disclosure on neurodegenerative diseases must not only consider cholinergic control but also monitor the PKC pathway

Özet

Amaç: Kolinesteraz (ChE) enzimleri anti-sens ve siRNA uygulamaları ile aralarında bir karşıt düzenlenme gösterir. Önceki çalışmamızda bu karşıt düzenlenim sırasında hücre çoğalması ve farklılaşması ile ilişkili PKC ve ERK yolaklarının aktivasyon durumunu değiştiğini gözlemlemiştik. BChE ifadesinde gerçekleşen azalma PKC-? yolağında artışa yol açar. Bu çalışmada ChE enzimleri ile PKC yolağı arasında var olan bu etkileşimin karşılıklı olduğunu gösteriyoruz. Gereç ve Yöntemler: Nihai 10 µM Di-octanoyl glycerol (DOG) ve BCHE'a yönelik 10 nM siRNA uygulanan R28 hücrelerinde gen/protein ifadesindeki değişiklikler RT-PCR, Western Blot, IHC ve aktivite ölçümleri ile incelenmiştir Bulgular: BChE nakavtı ile beraber DOG uygulaması, PKC-? ifadesinde tek başına DOG uygulamasından daha fazla artışa yol açtı. ERK1 ifadesindeki artış aynı derecede çarpıcı değildi. R28 hücrelerinin DOG ile uyarılmaları ise hem AChE hem de BChE ifadelerinde belirgin ve hızlı artışa neden oldu. Sonuçlar: BChE nakavtı sırasında PKC uyarımı işlevsel ve doygun AChE ifadesine neden olmuştur. Gözlenen PKC ifadesi, PKC-?'nın, uyarıcıları dışında BChE varlığı / yokluğu ile de düzenlendiğini düşündürür. PKC ve ERK uyarımı kolinerjik yolak üzerinde karşılıklı ve tamamlayıcı sonuca yol açar. PKC-? ve ChE'lar arasındaki bu etkileşim, nörodejeneratif hastalıkların değerlendiriminde ChE'lar ile beraber PKC yolağını da dikkate alınması gerektiğini gösterir