[Protein agregasyonunun ekstraselüler Termitomyces clypeatus fungal sükraz enzimi ile önlenmesi]

Prevention of protein aggregation by extracellular fungal sucrase of Termitomyces clypeatus

Abstract

Objective: Extracellular sucrase from Termitomyces clypeatus is known to impart stability and enhance activity of cellobiase, another secreted glycosidase of the fungus through co-aggregation with cellobiase. To explore whether sucrase can bind with some proteins like Insulin, BSA, alcohol dehydrogenase (ADH), carbonic anhydrase and whey proteins and prevent their dithiothreitol (DTT) induced/thermal aggregation and/or loss of activity measuring by spectrophotometry, gel filtration assay andactivity assays. Methods: MALDI-TOF and dynamic light scattering were used to assess the monomeric and aggregated molecular size of sucrase. Thermostatted spectrophotometric assays, gel filtration assays were used to study protein aggregation.Fluorescence of bound ANS was used to monitor temperature induced structural changes in sucrase together with determination of melting temperature.Results: The mass of the monomeric unit of sucrase as 6649 Da. Enzyme inhibited DTT induced aggregation of insulin and suppressed the thermal aggregation of carbonicanhydrase, ADH and whey proteins, respectively by 83%, 68% and 70% at 70°C. Sucrase also protected about 84% activity of ADH. Conclusion: An extracellular fungal sucrase with a low monomeric size can efficiently prevent protein aggregation. The studies can impart knowledge about potential therapeutic applications of this industrially importantenzyme in protein misfolding disorders.

Özet

Arka plan: Termitomyces clypeatus kaynaklı extraselüler sükrazın fungal kaynaklı glikozidaz ile agregatlaşarak selülaz aktivitesini ve stabilitesini artırdığı bilinmektedir.Amaç: Sükrazın protein benzeri olan insülin, BSA, alkol dehidrogenaz, karbonik anhidraz, süt proteinini bağlayıp bağlamadığı ve DTT ile indüklenmiş/termal agregasyonunun önlenip önelnmediğinin, buna bağlı olarak aktivitesinin aktivitesinin kaybolup kaybolmadığının spektrofotometrik, jel filtrasyon ve aktivite ölçümü ile incelenmesidir.Metod: Sükrazın monomerik ve agregatlaşmış molekül büyüklüğünün değerlendirilmesi için MALDI-TOF ve Dinamik ışık saçılımı yöntemleri kullanılmıştır. Termostatlı spektrofotometre yöntemi ve jel filtrasyon yöntemi protein agregasyonunu ölçmek için kullanılmıştır. Bağlı ANS'nin floresans sinyali ile sıcaklıkla indüklenmiş yapısal değişikliklerle birlikte erime noktasının izlenmesinde kullanılmıştır.Bulgular: MALDI-TOF analizine göre monomerik sükraz birimi 6649 Da olarak belirlenmiştir. DTT ile inhibe edilmiş enzimin insülin ile agragasyonu indüklenmiş ve karbonik andihraz, alkol dehidrogenaz ve süt proteininin termal agregasyonu 70°C de sırasyıla %83, %68 ve %70 olacak şekilde baskılanmıştır. Sükraz alkol dehidrogenazın aktivitesini %84 oranında korumuş ve agregatlaşmış insülinin tekrar çözünürlüğünü kolaylaştırmıştır. Sükrazın stabilize özelliği ile katalitik etkisi birbirinden bağımsızdır ve sükraz doğal yapısında olmasına rağmen 70°C de aktivitesini ANS bağlama ve erime noktası (Tm:68.3°C) çalışmaları verilerine göre kaybetmiştir.Sonuç: Bu çalışmaya göre elde edilen veriler, düşük monomerik yapılı fungal sükrazın protein agregasyonunu önlediği ilke defa bu çalışmada belirtilmiştir. Bu çalışma ile proteinlerin hatalı katlanmasında ortaya çıkacak rahatsızlıklarda kulanılabilme potansiyeli olan yeni bir terapötik yöntem sunulmuştur