Molecular cloning and functional identification of analgesic peptides from Buthus martensii Karsch

Buthus martensii (Karsch)’deki analjezik peptidlerinin moleküler klonlanması ve fonksiyonel tanımlanmaları

Abstract

Aim: To clone genes encoding analgesic peptides from the cDNA pool of scorpion telson, to obtain recombinant peptides by prokaryotic expression system and examine their analgesic activity in mouse twisting test. Material and methods: The genes encoding analgesic peptides were cloned from the cDNA pool of scorpion telson by nested PCR. Positive clones were sequenced after screened by PCR-SSCP. The recombinant peptides were obtained by functionally expression in E. coli and purified by metal chelating chromatography. The bioactivity was assayed in mouse twisting test. Results: Two nucleotide sequences encoding potential analgesic peptides were obtained. They were named as BmK 22 and BmK 9. BmK 22 was a new peptide with only one amino acid at site 54 different with BmK 9. In mouse-twisting test, both of the two recombinant peptides exhibited analgesic activity, and BmK 9 showed a stronger activity in pain relieving. Further, when considering structure factors by homology modeling, we speculated that the Arg residue at site 54 of BmK 9 may play an important role in target recognition and influence the analgesic activity. Conclusion: Venoms from scorpions contain extremely rich bioactive peptides. The strategy in this paper involving molecular cloning, functional expression and bioactivity identification of BmK 9 and BmK 22 provided a rapid route to discover scorpion toxins with special bioactivity such as analgesics

Özet

Amaç: Analjezik peptidleri kodlayan genlerin akrep iğnesinin cDNA havuzundan klonlanması, prokaryotik ekspresyon sistemi aracılığıyla rekombinant peptidlerin elde edilmesi ve peptidlerin analjezik aktivitelerinin fare kıvranma deneyi ile incelenmesi.Metodlar: Analjezik peptidleri kodlayan genler, akrep iğnesinin cDNA havuzundan nested PCR ile klonlandı. PCR-SSCP (PCR-Tek Zincir Konformasyon Polimorfizmi) ile tarandıktan sonra, pozitif klonlar sekanslandı. Rekombinanat peptidler, E. coli'de fonksiyonel ekspresyon ile elde edilip metal şelatlaştırıcı kromatografi ile saflaştırıldı. Biyo-aktivite fare kıvranma deneyi ile belirlendi.Bulgular: Potansiyel analjezik peptidleri kodlayan 2 nükleotid sekansı elde edildi. BmK 22 ve BmK 9 olarak adlandırıldılar. Yeni bir peptid olan BmK 22'nin, BmK 9'dan sadece 54. pozisyondaki bir amino asidi farklıydı. Fare kıvranma deneyi sonucunda, her iki rekombinant peptid analjezik aktivite gösterdi ve BmK 9'un ağrı azaltmada daha kuvvetli bir etkisi vardı. Ayrıca, homoloji modelleme ile yapısal faktörlerin değerlendirilmesi sonucunda, BmK 9'un pozisyon 54'ündeki arjininin hedef tanımada önemli bir rol oynadığını ve analjezik aktiviteyi etkilediğini düşünüyoruz.Sonuç: Akrep zehri çok zengin biyo-aktif peptidler içermektedir. Bu çalışmadaki BmK 9 ve BmK 22'nin moleküler klonlama, fonksiyonel ekspresyon ve biyo-aktivite belirlenmesi aşamaları, analjezikler gibi özel biyo-aktiviteye sahip akrep toksinlerinin belirlenmesi için hızlı bir yöntem sağlamaktadır