Purification and properties of a novel fungal alkaline keratinase from Cunninghamella echinulata

[Yeni fungal alkali keratinazın Cunninghamella echinulata’dan saflaştırılması ve özelliklerinin tanımlanması]

Sunil S MORE, Divya Lakshmi SRİDHAR, Sahana N PRAKASH, Swathi UMASHANKAR, Jyothi VİSHWAKARMA

Abstract

Aim: The purification and characterization of an alkaline keratinase from Cunninghamella echinulata.Materials and Methods: Feather-meal medium was used to isolate and screen the fungi. Acetone precipitation and lectin agarose affinity column were used in the purification. The effect of pH, temperature, metal ions and group modifying chemicals was tested.Results: The purified keratinase is a serine protease with a molecular mass of 33kDa with an optimal pH of 4.5 and 10.0, and an optimum temperature of 30°C and 60oC. A 13.2-fold purification was obtained with affinity methods. Discussion: C.echinulata keratinase was inhibited by PMSF, thus it could be a serine protease. Enzyme was inhibited by group specific reagents like TLCK, IAA, NEM and NAI indicating that serine, cysteine, tyrosine and lysine play an important role in the catalytic activity. There was no effect of metal-chelating agent on enzyme activity indicating that the enzyme is not a metalloenzyme; however, it is a metal-activated enzyme as the activity was enhanced by Mn²+. Inhibitory effects of group specific reagents indicated that the enzyme is a serine protease which does not have any divalent ion requirement. The enzyme isolated also has appreciable activity at two different temperatures and pH values making it a versatile organism for industrial applications

Özet

Amaç: Çalışmanın amacı Cunninghamella echinulata'dan alkali keratinazın saflaştırılması ve karakterizasyonudur. Gereç ve Yöntemler: Mantarın izole edilmesinde ve taranmasında temel tüylü besiyeri kullanılmıştır. Saflaştırmada aseton çöktürmesi ve lektin agaroz affinite kolonu teknikleri uygulanmıştır. Sıcaklık, pH, metal iyonları ve grup modifiye edici kimyasalların etkisi araştırılmıştır.Bulgular: Saflaştırılan keratinaz, molekül kütlesi 33 kDa, optimum pH'sı 4.5 ve 10, optimum sıcaklığı ise 30°C ve 60oC olan serin proteazdır. Keratinaz affinite teknikleri ile 13.2 kat saflaştırılmıştır.Sonuç: C.echinulata keratinazının PMSF ile inhibe olması bu enzimin serin proteaz olabileceğini göstermektedir. Enzim TLCK, IAA, NEM ve NAI gibi grup özgül ajanlar ile inhibe olmakta ve bu durum serin, sistein, tirozin ve lizin amino asitlerinin katalitik aktivitede önemli rol oynadığını ortaya koymaktadır. Metal-kelatlayıcı ajanların enzim aktivitesi üzerine bir etkilerinin olmayışı keratinazın metalloenzim olmadığını gösterse de enzim aktivitesinin Mn²+ ile artışı enzimin metal ile aktive olduğunu belirtmektedir. Grup özgül ajanların inhibitor etkisi enzimin herhangi bir divalan iyona gereksinim duymayan bir serin proteaz olduğunu göstermektedir. İzole edilen enzimin iki farklı sıcaklık ve pH noktasında aktiviteye sahip olması endüstriyel uygulamalarda değişken olmasını sağlamaktadır