Molecular detection of Bacillus anthracis: evaluation of the efficiency of DNA extraction and a novel dry PCR

Bacillus anthracis’in moleküler tespiti: DNA ekstraksiyonu ve yeni bir kuru PCR yönteminin etkinliğinin değerlendirilmesi

Abstract

Background: Due to recent increase in mailings of anthraxspores, the detection of bioweapons has gained a greatdeal of interest. This study aimed to investigate the yieldand purity of DNA obtained from spores and vegetativeforms of Bacillus anthracis for detection by conventional(wet) and dry (lyophilized) PCR methods.Materials and methods: Biosamples from stock solution were reconstituted to a concentration 108 cfu/mL followed by the spectrophotometric measurement of theyield and purity of acquired DNA. Twelve wet and 12 dryPCR studies of four various DNA dilution samples wereperformed for each three target gene (cap, pag, sap) ofB. anthracis.Results: Significant differences for both DNA yields andpurity were found between liquid-agar and liquid-sporesamples. No significant difference was observed betweenwet and dry PCR in concentration of 2.5 ng/μL DNA for allgene regions. PCR results of sap gene region with DNAconcentrations of 1.5 ng/μL and 0.9 ng/μL was foundstatistically significant in favor of conventional wet PCRmethod (p = 0.047 and p ≤ 0.001, respectively).Conclusion: It is concluded that B. anthracis cultivatedin liquid medium is more usable than vegetative or sporeform obtained on plate agar for proper DNA extraction.

Özet

Amaç: Son zamanlarda antraks sporlarının postalayla gönderilmesindeki artış nedeniyle, biyolojik silahların tespiti büyük önem kazanmıştır. Bu çalışma, Bacillus anthracis’in konvansiyonel (ıslak) ve kuru (liyofilize) PCR yöntemleri ile saptanmasında spor ve vejetatif formlardan elde edilen DNA’nın miktar ve saflığını araştırmayı amaçlamıştır. Gereç ve Yöntem: Stok çözeltiden elde edilen numuneler 108cfu/mL konsantrasyona getirildi, ardından elde edilen DNA’nın miktar ve saflığı spektrofotometrik yöntemle ölçüldü. Dört farklı DNA dilüsyonunda B. anthracis’in üç hedef gen bölgesine (cap, pag, sap) yönelik 12 ıslak ve 12 kuru PCR çalışması gerçekleştirildi. Bulgular: Sıvı-agar ve sıvı-spor örnekleri arasında hem DNA miktarı hem de saflığı açısından istatistiksel önemli fark bulundu. Tüm gen bölgeleri için 2.5 ng/μL DNA konsantrasyonunda ıslak ve kuru PCR arasında anlamlı bir fark gözlenmedi. Sap gen bölgesine yönelik uygulanan PCR’da, 1.5 ng/μL ve 0.9 ng/μL DNA konsantrasyonlarında konvansiyonel ıslak PCR yöntemi lehine istatistiksel anlamlı fark belirlendi (sırasıyla, p = 0.047 ve p ≤ 0.001). Sonuç: Uygun DNA ekstraksiyonu açısından sıvı ortamda üretilen B. anthracis’in agarda üretilen vejetatif veya spor formundan daha uygun olduğu sonucuna varılmıştır.