Site-directed mutagenesis of cephalosporin C acylase and enzymatic conversion of cephalosporin C to 7-aminocephalosporanic acid

Sefalosporin C açilazın bölge-hedefli mutasyonları ve sefalosporin C'nin 7-aminosefalosporonik aside enzimatik dönüşümü

Abstract

Objective: A cephalosporin C acylase catalyzes hydrolysis of cephalosporin C to 7-aminocephalosporanic acid directly. This work was considered helpful for the further study of the cephalosporin C acylase and also useful for the strain improvement.Methods: Its mutant (G139?S/F58?N/I75?T/I176?V/S471?C) named A12 was cloned into pET28a (+) vector and expressed in E.coli BL21 (DE3). The three dimentional structure of A12 was constructed by the homology modeling and its' catalytic sites was analyzed by the DOCK software.Results: The mutant A12 was expressed in E.coli BL21 (DE3) with the molecular weight 87kDa containing two subunits of 58kDa ?-subunit and 25kDa ?-subunit. The activity of A12 was 291 U/L which was lower than that of AcyII (322 U/L) because of the low expression level. The specific activity of A12 was 6.011 U/mg which was higher than that of the AcyII (2.868 U/mg). Catalytic analysis suggested that A12 had the improved catalytic efficiency (kcat/Km) to convert cephalosporin C to 7-ACA at the beginning of the reaction. These results combined with the model analysis indicated that Phe58??Ile75? and Ile176? were involved in the catalysis from CPC to 7-ACA.Conclusion: In this work, the gene of cephalosporin C acylase AcyII was synthesized, mutated and expressed successfully in the E.coli BL21 (DE3). The specific activity and the catalytic efficiency of A12 increased 2-fold and 3-fold respectively. Compared with the study of cephalosporin C acylase in N176, this work was considered helpful for the further study of the catalytic mechanism of cephalosporin C acylase and also useful for the strain improvement for the cephalosporin C acylase production.

Özet

Amaç: Sefalosporin C açilaz, sefalosporin C'nin 7-aminosefalosporonik aside hidrolizini direkt katalizler. Bu çalışmanın, sefalosporin C ile ileride yapılacak çalışmalara faydalı olmasının yanısıra, suş gelişimi için de faydalı olacağı düşünüldü.Gereç ve Yöntemler: A12 olarak isimlendirilen mutant (G139?S/F58?N/I75?T/I176?V/S471?C), vektör pET-28a (+)'a kopyalandı ve E.coli BL21 (DE3) de ifade edildi. A12'ye ait üç boyutlu yapı homoloji modelleme ile oluşturuldu ve katalitik bölgeleri DOCK yazılımı ile analiz edildi.Bulgular: E.coli BL21 (DE3)'de A12 olarak isimlendirilen mutant, 87kDa moleküler ağırlıklı 58kDa ?- ve 25kDa ? içeren 2 altbirim ile ifade edildi. 291 U/L olan A12 aktivitesi, zayıf ifade edilme düzeyine bağlı olarak AcyII (322 U/L)'den de düşüktü. Ancak A12 spesifik aktivitesi (6.011 U/mg) AcyII (2.868 U/mg) spesifik aktivitesinden yüksekti. Katalitik analizler sonucunda reaksiyonun başında A12'nin sefalosporin C'yi 7-ACA'ya dönüştürebilecek gelişmiş katalitik verime (kcat/Km) sahip olduğu öne sürüldü. Bu sonuçlar model analizler ile birleştirildiğinde CPC'den 7-ACA'ya katalizde Phe58?, Ile75? ve Ile176?'nın da bulunduğu gösterildi.Sonuç: Bu çalışmada, sefalosporin C açilaz Acy II geni E.coli BL21 (DE3) de başarıyla sentezlendi, mutasyona uğradı ve ifade edildi. A12 spesifik aktivitesi ve katalitik verimi sırasıyla 2 ve 3 kat arttı. N176 da bulunan sefalosporin C açilaz çalışması ile kıyaslandığında bu çalışmanın sefalosporin C açilazın katalitik mekanizmalarına yönelik çalışmalarda ve sefalosporin C açilaz üretimi için suş geliştirilmesinde faydalı olacağı düşünülmüştür.