[Ser159 mutation of the pre-initiation complex protein TaF7 CaUSES a G2/M block in cell cycle]

Pre-inisiyasyon transkripsiyon kompleksi proteinlerinden TAF7'nin Ser159 mutasyonu hücre döngüsü G2/M geçişinde yığılıma yol açıyor

Abstract

Objective: TATA Binding Protein (TBP) associated factors (TAFs) have been shown to participate in transcriptional regulation. TAF7 is one of the TAFs, which role has been emphasized in the regulation of transcription and cell cycle. It has been suggested that TAF7 acts at a check point at the initiation of transcription by not leaving the pre-initiation complex until it is completely and correctly built. It has also been reported that TAF7 play a role in cell cycle regulation and is hyper-phosphorylated on Ser159 at the G2/M checkpoint. To study the effect of this phosphorylation on cell cycle kinetics, we did cell cycle analyses on WT and TAF7 Ser159 mutant cells in a tetracycline controlled expression system.Methods: TAF7's Ser159 amino aside was converted to Ala159 by site directed mutagenesis. Both WT TAF7 and Ser159 mutant TAF7 vectors were cloned into tetracycline controlled expression plasmids and stable transfected into HeLa cells. Cell cycle analyses were performed by measuring DNA content by flow cytometry.Results: Cells stabily transfected with mutant TAF7 accumulated at the G2/M checkpoint. These cells displayed no defect in entering the cell cycle or in passing through S phase.Conclusion: Our results suggest that TAF7's Ser159 phosphorylation has a functional yet undefined role in G2/M transition of the cell cycle; and emphasizes the need for more intensive studies.

Özet

Amaç: Transkripsiyonun kontrolünde "TATA Bağlayan Protein (TBP) Asosiye Faktörlerin" (TAF) rol oynadığı düşünülmektedir. Bu TAF'lardan TAF7, transkripsiyon ve hücre döngüsünün düzenlenmesi ile ilgili olarak üzerinde durulan proteinlerden bir tanesidir. TAF7'nin tam ve doğru bir bazal transkripsiyon kompleksi oluşana kadar transkripsiyonu baskıladığı, ancak tam ve doğru bir kompleks oluştuğunda transkripsiyonun başlamasına izin veren bir kontrol noktasında görev aldığı ileri sürülmüştür. TAF7 hücre döngüsünün regülasyonunda da rol oynadığı ve G2/M geçişinde, Ser159 aminoasidinden fosforillendiği bildirilmiştir. Ancak TAF7'nin hücre döngüsü kinetikleri üzerindeki doğrudan etkisi bilinmemektedir. Bu etkiyi incelemek amacıyla tetrasiklinle regüle edilen (TREX) sistem ile HeLa hücrelerinde, TAF7'nin yabanıl ve Ser159 mutant formlarının yüksek düzeyde kontrollü ekspresyonlarını sağlayarak hücre döngüsü analizlerini gerçekleştirdik.Metod: Bölgeye yönelik mutagenez yöntemi ile TAF7'nin Ser159 aminoasidi alanine dönüştürüldü. Yabanıl tip ve mutant TAF7 genleri klonlandi ve tetrasiklin ile indüklenebilen bir ekspresyon sistemine klonlanan plasmidlerin stabil transfeksiyonu gerçekleştirildi. Akım sitometrisiyle hücre DNA içeriği incelenerek hücre döngüsü analizleri gerçekleştirildi.Bulgular: Fosforillenemeyen Ser159 mutant TAF7 barındıran hücreler, hücre döngüsünün G2/M geçişinde yığılım gösterdi. Sonuçlarımız TAF7 Ser159 fosforilasyon mutantı hücrelerin döngüye girme ve M fazına kadar ilerlemede bir sorun yaşamadıklarını ancak mitoz aşamasına geçişte defektif olduklarını göstermektedir.Sonuç: Bulgularımız TAF7'de gözlenen Ser159 modifikasyonunun işlevsel bir karşılığı olduğunu göstermekte ve hücre döngüsü kontrolünde daha önce çalışılmamış bir protein grubunun önemini vurgulamaktadır.