Comparison of the efficiency and relevancy of reference genes in crayfish tissue samples

Kerevit doku örneklerinde referans genlerin geçerlilik ve etkinliğinin karşılaştırılması

Abstract

Objective: Relevancy of the reference genes have not been investigated in crayfish tissue samples. Various genes have been proposed for establishing a reference level to analyze qPCR results obtained in different tissue samples. However, majority of those genes have been investigated solely in mammalian species. There is no report related to the relevancy and the efficiency of those common reference genes in crayfish tissue samples yet. The primary aim of the present work is to compare the expression level of a set of reference genes in various crayfish tissue samples to establish a reliable reference gene for quantitative expression level comparisons.Methods: cDNA copies were synthesized by RT-PCR from equalised total RNA samples of nine different tissue samples. qPCR were performed on cDNA samples by using four different primer pairs specific for ?-actin, Peptidylprolyl Isomerase B, Sarcoplasmic Calcium Binding Protein and 18S ribosomal RNA genes.Results: qActin2 amplified gene fragments for ?-actin in all samples. Cycle time of the amplification reaction differed substantially between the investigated tissue types. A similar difference was observed between the melting curves of the products. The primer pair PPIB amplified gene fragments for Peptidylprolyl Isomerase B only in heart, muscle and intestine samples but not in the rest of the tissue samples. Further, both amplification and melting curves for heart, muscle and intestine were different. qSCP. amplified some gene fragments for Sarcoplasmic ReticulumBinding Protein only in muscle, heart and ganglionsamples. The 18S_1 amplified fragments for 18S. Amplificationcurves the samples superimposed on each other.Melting curves of the products were very similar. Varianceof the obtained data was the lowest for 18S ribosomal RNA.Conclusion: In refer to present results; it is conceivableto propose that among all the genes investigated in thepresent study, expression level of ribosomal 18S RNA isthe most homogeneously distributed one within the bodyparts of the crayfish. Further, it is minimally affected byextreme biological changes such as molting. Thus, 18SRibosomal RNA would be suggested as a reference geneto be used when investigating tissue specific expressionlevel of a gene in the crayfish.

Özet

Amaç: qPCR sonuçlarının analizinde belli bir referans değer oluşturmak için bir dizi referans gen önerilmiştir. Ancak, bu genlerin büyük bir kısmı memeli dokularında araştırılmıştır. Kerevit dokularında bu genlerin etkinlik ve geçerliliğini araştıran bir çalışma henüz mevcut değildir. Mevcut çalışmanın temel amacı bir dizi referans genin farklı kerevit doku örneklerindeki ifade düzeylerini karşılaştırarak, ifade düzeylerinin nicel olarak karşılaştırılması için güvenilir bir referans gen belirlemektir.Metod: Dokuz farklı doku örneğinden elde edilen total RNA örneklerinden RT-PCR ile cDNA kopyaları sentezlendi. cDNA örneklerinden ?-aktin,Peptidil izomeraz B, Sarkoplazmik kalsiyum bağlayıcı protein ve 18S ribosomal RNA'ya spesifik dört farklı primer kullanılarak qPCR gerçekleştirildi.Bulgular: qAktin2 primeri tüm örneklerde ?-aktin gen kısımları çoğalttı. Çoğaltma döngü zamanı araştırılan dokularda büyük farklılıklar gösterdi. Benzer bir farklılık erime eğrilerinde de gözlendi. PPIB primeri sadece kalp, kas ve barsak örneklerinde peptidil izomeraz geni kısımları çoğalttı. Ayrıca kalp, kas ve barsak örnekleri için oluşan erime eğrileri de farklıydı. qSCP sadece kalp, kas ve gangliyon örneklerinde sarkoplasmik kalsiyum bağlayıcı protein gene kısımları üretti. 18S_1 primeri tüm dokularda 18S kısımları üretti. Dokulara ait kopyalanma eğrileri üst üste çakışmaktaydı. Ürünlerin erime eğrileri de benzerdi. Verilerin değişkenliği 18S ribosomal RNA için en düşüktü.Sonuç: Mevcut bulgulara göre; çalıştığımız genler arasında kerevit dokularında ifade düzeyi en homojen olan ribosomal 18S RNAsıdır. Bundan öte bu durum kabuk değiştirme gibi uç bir biyolojik durumdan bile en düşük olarak etkilenmekteydi. Bu sonuçlarla ribosomal 18S RNAsı kerevit dokularında doku spesifik ifade düzeyleri araştırılırken referans olarak önerilmektedir.