Journals / Türk Biyokimya Dergisi / 2019 / Cilt: 44 - Sayı: 6
A method for high-purity isolation of neutrophil granulocytes for functional cell migration assays
- Journal
- Türk Biyokimya Dergisi
- Pages
- 810–821
- DOI
- —
Abstract
Background: Neutrophil-mediated killing of pathogensis one of the most significant functions of the primarydefense of the host. Neutrophil activity and migration playa key role in inflammatory conditions. To gain insightsinto the interactions between neutrophils and neutrophilmigration-related disorders, a large number of sophisticated methods have been developed. The technical limitations of isolating highly purified neutrophil populations,minimizing both cell death and activation during the isolation process, and the short lifespan of neutrophils presentchallenges for studying specific functions of neutrophilsin vitro. In this study, we aimed to evaluate a separationmedium-based density gradient method to obtain highlypurified neutrophil populations and combined this protocol with a model for studying neutrophil migration in-vitro.Materials and methods: Human granulocytes were isolated using Lympholyte-poly solution. The purity andviability of isolated neutrophils were assessed by flowcytometry and morphological analysis. Neutrophil activation was confirmed by immunocytochemistry. Lastly, filterassay was performed to measure neutrophil chemotaxis.Results and discussion: All validation experiments revealedthat this method was capable of generating a highly purified neutrophil population for further functional in-vitroassays. Consequently, this study demonstrates a quick, costeffective, and easy-to-follow model, and may be a significant alternative to isolation methods that need extra subsequent steps such as flow cytometry-based cell sorting forreaching highly purified neutrophil population.Conclusion: The suggested combination of methods forthe isolation and cell migration analysis of human neutrophils is highly recommended to use for disease modelsinvolving neutrophil migration such as autoinflammatorydisorders.
Özet
Amaç: Doğal bağışıklık sisteminde, konağın birincil savunması ve patojenlerin öldürülmesi nötrofillerin en önemli işlevlerinden biridir. Nötrofil aktivitesi ve göç, inflamatuvar koşullarda önemli bir rol oynar. Nötrofiller ve nötrofil göçü ile ilişkili bozukluklar hakkında bilgi edinmek için çok sayıda yöntem geliştirilmiştir. Ancak yüksek saflıkta nötrofil popülasyonlarının izole edilmesinin teknik sınırlamaları, izolasyon sırasında hem hücre ölümünü hem de aktivasyonu en aza indirgeyen nötrofillerin kısa ömrü, nötrofil göçü ile ilişkili hastalıklarda yapılan araştırmalarda nötrofillerin fonksiyonlarını inceleme aşamasında zorluklara neden olmaktadır. Bu çalışmada, yüksek oranda saflaştırılmış nötrofil popülasyonları elde etmek için yoğunluk gradyanı temelli ayırma çözeltisi kullanılan bir metodu değerlendirdik ve bu protokolü, nötrofil göçünü in vitro koşullarda incelemek için bir deney sistemi ile birleştirdik. Gereç ve Yöntemler: İnsan granülositleri, Lenfolit poli çözeltisi kullanılarak izole edildi. İzole edilmiş nötrofillerin saflığı ve canlılığı akım sitometrisi ve morfolojik analizler ile değerlendirildi. Nötrofillerin aktivasyonu immünositokimya ile doğrulandı. Son olarak, nötrofil göçünü-kemotaksisini ölçmek için filtre deneyi yapıldı. Bulgular ve Tartışma: Tüm validasyon deneyleri, bu izolasyon yöntemi ile, fonksiyonel deneyler için saflaştırılmış bir nötrofil popülasyonu elde edilebildiğini gösterdi. Sonuç olarak, nötrofil izolasyonu ve devamında hücre göçü analizlerini içeren bu çalışma; hızlı, uygun maliyetli ve takip edilmesi kolay bir model ortaya koymaktadır ve nötrofil popülasyonunu elde etmek için akım sitometrisi temelli hücre sınıflaması gibi ilave adımlar gerektiren izolasyon yöntemlerine önemli bir alternatif olabilir. Sonuç: İnsan nötrofillerinin izolasyonu ve fonksiyonel hücre göçü analizi için geliştirilen bu yöntemlerin, nötrofil göçünü içeren hastalık modellerinde kullanılması önerilir.