A single-tube multiplex qPCR assay for mitochondrial DNA (mtDNA) copy number assessment

Mitokondriyal DNA (mtDNA) Kopya Sayısı Belirlemede Tek Tüpte Multiplex qPCR Yöntemi

Abstract

Objective: Detection of mtDNA copy number is requiredfor diagnosis of mtDNA depletion. Multiplex quantification of mtDNA in blood samples was claimed via normalizing to a nuclear single copy gene using qPCR. This is notpossible in high mtDNA samples due to template abundance. Multiplex qPCR assays cannot be normalized to single copy sequences of the nuclear genome.Methods: mtDNA quantification was tested normalizingto a single copy nuclear gene via singleplex and multiplex reactions. Failure in normalization directed to design and test targeting multi-copy 18S rDNA gene with success.mtDNA quantification was standardized both in separateand multiplexed single-tube reactions based on molecularbeacon technology.Results: mtDNA copy number assessment cannot be normalized to a single copy sequence in high-copy-number tissues. However, normalizing mtDNA to the nuclear 18SrDNA multiple copy sequence is amenable to be standardized in single tube. When compared, multiplexing exhibited higher resolution power for quantification of mtDNA invarious samples from the most abundant to the scant ones.Conclusion: We describe a multiplex assay that canbe translated as a standard technique for single-tubequantification of mtDNA copy number. Our findingsshow higher accuracy and reproducibility over canonicalapproach, reducing cost and error rate.

Özet

Amaç: Mitokondriyal deplesyon tanısında, mtDNA kopya sayısının belirlenmesi gerekmektedir. Bu amaçla qPCR tekniği ile mtDNA sayısı, genomda yer alan tek kopya dizilere oranlanmaktadır. Multipleks qPCR ile kan dokusunda gerçekleştirilebilen nicel ölçüm, hedef DNA kalıbı oranındaki dengesizlik nedeni yüksek mtDNA içeren dokularda uygulanamamaktadır. Gereç ve Yöntem: Nicel mtDNA kopya sayısı çekirdek genomunda yer alan tek kopya diziye oranlanarak belirlenmeye çalışıldı. Farklı tüplerdeki tepkimelerde başarılı olan işlemin mültipleks tepkimede başarısız olduğu gözlendi. Bireyler arasında tekrar sayısı değişmeyen, çok kopya bir referans dizi olarak 18S rDNA genini hedefleyen bir qPCR yaklaşımı tasarlandı ve denendi. Moleküler beacon teknolojisi kullanımı ile tasarlanan qPCR tepkimesi ayrı tüplerde ve tek tüpte (mültipleks) standardize edildi. Bulgular: Yüksek kopya mtDNA içeren dokularda, mtDNA sayısı, çekirdek genomunda yer alan tek kopya dizi referans alınarak tek tüpte belirlenemedi. Bu durumun nedeninin, iki amplikon arasındaki 8 döngü fark olduğu anlaşıldı. Oranlama için genomda çok kopya halinde bulunan 18S rDNA dizisi kullanılarak, aynı tepkime tüpü içinde mtDNA kopya sayısı tekrarlanabilir ve güvenilir şekilde belirlendi. Sonuç: mtDNA kopya sayısı belirlemede, etkin ve güvenilir bir standart teknik olarak kullanılmak üzere tek-tüp (mültipleks) qPCR testi geliştirilmiş ve standardize edilmiştir. Tanımlanan test, güvenilirliği ve tekrarlanabilirliğinin yanında maliyet ve hata risklerini azaltarak farklı tüplerde gerçekleştirilen qPCR yaklaşımına üstünlük sağlamaktadır