Identification of cytoplasmic sialidase NEU2-associated proteins by LC-MS/MS

Sitoplazmik sialidaz NEU2 ile ilişkili proteinlerin LC-MS/MS ile tanımlanması

Abstract

Background: Cytoplasmic sialidase (NEU2) plays an active role in removing sialic acids from oligosaccharides, gly- copeptides, and gangliosides in mammalian cells. NEU2 is involved in various cellular events, including cancer metabolism, neuronal and myoblast differentiation, pro- liferation, and hypertrophy. However, NEU2-interacting protein(s) within the cell have not been identified yet.Objective: The aim of this study is to investigate NEU2 interacting proteins using two-step affinity purification (TAP) strategy combined with mass spectrometry analysis. Methods: In this study, NEU2 gene was cloned into the pCTAP expression vector and transiently transfected to COS-7 cells by using PEI. The most efficient expression time of NEU2- tag protein was determined by real-time PCR and Western blot analysis. NEU2-interacting protein(s) were investigated by using TAP strategy combined with two different mass spectrometry experiment; LC-MS/MS and MALDI TOF/TOF.Results: Here, mass spectrometry analysis showed four proteins; -actin, -actin, calmodulin and histone H1.2 proteins are associated with NEU2. The interactions between NEU2 and actin filaments were verified by Western blot analysis and immunofluorescence analysis. Conclusions: Our study suggests that association of NEU2 with actin filaments and other protein(s) could be important for understanding the biological role of NEU2 in mammalian cells

Özet

Geçmiş: Sitoplasmik sialidaz (NEU2) memeli hücrele- rinde oligosakkaritler, glikopeptidler ve gangliosidlerden sialik asitin uzaklaştırılmasında aktif bir rol oynamakta- dır. NEU2, kanser metabolizması, nöron farklılaşması ve miyoblast çoğalması, farklılaşması ve hipertrofisini içeren farklı hücresel olaylarda görev yapmaktadır. Bununla bir- likte, hücre içerisinde NEU2 ile ilişkili protein(ler) henüz tanımlanmamıştır. Amaç: Bu çalışmanın amacı iki-basamak afinite saf- laştırma (TAP) stratejisi ile birlikte kütle spektrometri analizini kullanarak NEU2 ile etkileşen proteinleri araştırmaktır. Malzemeler ve Metodlar: Bu çalışmada, NEU2 geni pCTAP ekspresyon vektörüne klonlandı ve PEI kullanılarak geçici olarak COS-7 hücrelerine transfekte edildi. Rekombi- nant NEU2 –tag proteininin en etkili ifade süresi, gerçek zamanlı PCR ve Western blot analizi ile belirlendi. NEU2 ile etkileşen protein(ler), TAP stratejisi ve iki farklı kütle spektrometresi deneyi kombine ederek araştırıldı; LC-MS/ MS ve MALDI TOF/TOF. Bulgular: Burada, kütle spektrometresi analizine göre NEU2, -aktin, -aktin, kalmodulin ve histon H1.2’yi etki- leşime girebilmektedir. NEU2 ve aktin filamentleri arasın- daki etkileşim, Western blot ve immünofloresan analizi ile doğrulanmıştır. Sonuç: Çalışmamız, NEU2’nin aktin filamentleri ve diğer protein (ler) ile etkileşmesinin, memeli hücrelerinde NEU2’ nin biyolojik rolünü anlamak için önemli olabileceğini düşündürmektedir.